تقدير تركيز البروتين الكلي و تركيز الكلوبيولين المناعي في المصل و الافرازات

تقدير تركيز البروتين الكلي و تركيز الكلوبيولين المناعي في المصل و الافرازات
1- الهدف
تقدير البروتين الكلي في المصل.
تقدير الكلوبيولين المناعي في المصل.
تقدير الكلوبيولين المناعي في الافرازات.
2- الاساس العلمي
1- استخدام طريقة ناجحة لفصل البروتين و الكلوبيولين المناعي من الافرازات.
2- فصل المصل بالمنبذ.
3- تفاعل بيوريت هو اختبار كيميائي يستخدم لمعايرة البروتين في الدم والسوائل الحيوية للجسم وذلك وبوجود شوارد النحاس في وسط قلوي . وينتج عنه معقدات بنفسجية اللون بحيث تتناسب شدة اللون مع تركيز البروتين وذلك تبعا ل قانون بير-لامبرت وتتم معايرة هذا التفاعل اللوني بالاستفادة من جهاز مقياس الطيف الضوئي وبطول موجي 560 nm يتم في هذه الطريقة تفاعل ايونات النحاس مع الاواصر الپبتدية المكونة للبروتينات لتعطي اللون الازرق او البنفسجي. لحدوث هذا التفاعل لابد من وجود اصرتين پبتدية او اكثر ليتكون اللون البنفسجي .ان هذا التفاعل يعطي فكره عن مدى المناعه الغير متخصصه للفرد اي كونه ذو مناعة غير متخصصة جيدة او متوسطة او واطئة.
3- طريقة العمل
تحضير محلول الكلايكول المتعدد الاثلين(PEG):
يتم توزين 3 غرام من محلول منظم ترس و اذابته في 250 مل ماء مقطر وبعد ذلك يتم اضافة 1.5 غرام (PEG) واذابته في 250 مل محلول منظم ترس . يتم تعديل الاس الهيدروجيني(PH) للمحلول الناتج الى 7.4 باستخدام محلول NaOH (1M).


أ- تقدير البروتين الكلي في المصل :
1-يفصل الدم المسحوب من دون مانع التجلط بواسطة المنبذ2500 د/ د لمدة عشرة دقائق.
2-يؤخذ 0.1 مل من المصل ويضاف الى 5 مل من محلول بايوريت.
3- تقرا النتيجة بعد فترة حضانة في الظلام لمدة 15 دقيقة على طول موجي 560 nm بالمطياف الضوئي.
ب- تقدير الكلوبيولين المناعي في المصل:
1- خذ 5 مل من المصل و اضف له 0.9 غم من مسحوق كبريتات الصديوم اللامائي و يحضن لمدة نصف ساعة بدرجة 25?م.
2- يوضع المحلول في المنبذ بسرعة 3500 د/ د لمدة عشرة دقائق ثم يتم رمي الرائق و اضافة 2.5 مل من الماء المقطر لاذابة الراسب.
3- يضاف 0.7 غم من مسحوق كبريتات الامونيوم ( صوديوم) و يحضن لمدة 15 دقيقة .
4- يوضع المحلول في المنبذ بسرعة 3500 د/ د لمدة عشرة دقائق ثم يتم رمي الرائق و اضافة 2.5 مل من الماء المقطر لاذابة الراسب.
5- يؤخذ 0.1 مل من المحلول ويضاف الى 5 مل من محلول بايوريت.
6- تقرا النتيجة بعد فترة حضانة بالظلام لمدة 15 دقيقة على طول موجي 560 nm بالمطياف الضوئي.
ج- تقدير الكلوبيولين المناعي في المصل باستخدام محلول الكلايكول المتعدد الاثلين:
1-يؤخذ 5 مل من المصل و يضاف له 5 مل من محلول الكلايكول المتعدد الاثلين ثم يحضن لمدة نصف ساعة بدرجة 25?م.
2- يوضع المحلول في المنبذ بسرعة 3500 د/ د لمدة عشرة دقائق ثم يتم رمي الرائق و اضافة 1مل من المحلول الفسيولوجي لاذابة الراسب.
3- يؤخذ 0.1 مل من المحلول ويضاف الى 5 مل من محلول بايوريت.
4- تقرا النتيجة بعد فترة حضانة بالظلام لمدة 15 دقيقة على طول موجي 560 nm بالمطياف الضوئي.
د- تقدير الكلوبيولين المناعي في الافرازات:
1- تخلط و تجانس عينة البراز.
2- يؤخذ 2 غم من البراز و يضاف لها 10 مل من المحلول الفسلجي بتركيز %0.5.
3- يوضع المحلول في المنبذ بسرعة 3500 د/ د لمدة نصف الساعة.
4- يجمع الرائق وينبذ بسرعة 4000 د/ د لمدة 15 دقيقة .
5- يتم اضافة 5 مل من محلول كبريتات الامونيوم بتركيز %40 الى 5 مل من الرائق و يوضع المحلول بدرجة حرارة الغرفة لمدة نصف ساعة.
6- يوضع المحلول في المنبذ بسرعة 3500 د/ د لمدة نصف الساعة ثم يتم رمي الرائق و اضافة1 مل من المحلول الفسلجي للراسب و يحفظ بالثلاجة.
7 – يؤخذ 0.2 مل من المحلول اعلاه ويضاف اليه 5 مل من محلول بايوريت.
8- تقرا النتيجة بعد فترة حضانة في الظلام لمدة 15 دقيقة على طول موجي 560 nm بالمطياف الضوئي.

ذ- تقدير الكلوبيولين المناعي في الادرار باستخدام محلول الكلايكول المتعدد الاثلين :
1- يجمع 5 مل ادرار ويوضع في المنبذ بسرعة 3500 د/ د لمدة نصف الساعة.
2- يجمع الراشح ويوضع في انبوبة معقمة.
3- يؤخذ 3 مل من الراشح و يضاف له 3 مل من محلول الكلايكول المتعدد الاثلين ثم يحضن لمدة نصف ساعة بدرجة 25?م.
4- يوضع المحلول في المنبذ بسرعة 3500 د/ د لمدة عشرة دقائق ثم يتم رمي الرائق و يضاف 1مل من المحلول الفسيولوجي لاذابة الراسب.
5- يؤخذ 0.1 مل من المحلول ويضاف الى 5 مل من محلول بايوريت.
6- تقرا النتيجة بعد فترة حضانة بالظلام لمدة 15 دقيقة على طول موجي 560 nm بالمطياف الضوئي.







Data for Standard Curve of Bovine Serum Albumin -Biuret Solution
Tube # Stock BSA Solution (1000µg/ml) dH2O Biuret
Reagent Final Conc.
(µg/ml) Abs. 1 Abs. 2 Mean
Abs.
1(blank) 0 mL 10 ml 4 ml 0 0 0 0
2 1 ml 9 ml 4 ml 71.4 0.013 0.013 0.013
3 2 ml 8 ml 4 ml 142.9 0.031 0.031 0.031
4 3 ml 7 ml 4 ml 214.3 0.048 0.048 0.048
5 4 ml 6 ml 4 ml 285.7 0.049 0.049 0.049
6 5 ml 5 ml 4 ml 357.1 0.057 0.057 0.057
-
Tube # Stock Unknown dH2O Biuret
Reagent Final Conc.
(µg/ml) Abs. 1 Abs. 2 Mean
Abs.
Unknown. 1 10 ml 0 ml 4 ml 340 0.068 0.068 0.068
Unknown. 2 10 ml 0 ml 4 ml 405 0.081 0.081 0.081


Table. Absorbance of BSA/Biuret Solution at Various Wavelengths (tube #2).

Wavelength Absorbance
540 nm 0.012
560 nm 0.013
580 nm 0.010


Fig. - Graph of concentration vs. absorption of BSA-Biuret solution. The yellow lines are rough estimate of the unknown concentrations based on observed absorption values. The best fit line, and the equation for the best fit line is displayed on the graph.