مقدمة عن البكتريا الصناعية :

الاحياء المجهرية الصناعية Industrial Microbiology
مقدمة عن البكتريا الصناعية :
تطور علم البكتريا الصناعية بشكل كبير خلال النصف الثاني من القرن العشرين حيث تم بواسطته تحضير الكثير من المنتجات الصناعية المهمة في الزراعة والصناعة والطب مثل المضادات الحياتية والسترويدات والفلوريدات والاحماض العضوية والهرمونات و الانزيمات والمبيدات . تتعلق اهمية البكتريا الصناعية باكتشاف الكثير من الاحياء المجهرية في الطبيعة وكذلك التعرف على الكثير من المواد الخام التي تصلح لتكون مادة غذائية لتنمية وتكثير هذه الكائنات المجهرية .ومن الظروف المؤدية الى نجاح هذا العلم هي دراسة السلالات المصنعة العالية الانتاج والكشف عن صفاتها الوراثية لغرض التحكم بها عن طريق الطفرات المستحدثة لأجل انتخاب احسن السلالات من ناحية الانتاج . ودراسة العوامل الفيزيائية الكيميائية المؤثرة على عملية التطفير .
ان استعمال هذه العوامل لاجراء طفرات جينية لعدد كبير من الاحياء المجهرية اعطى امكانية تطور علم تقنية الاحياء المجهرية الصناعية . وتعرف التقنية الحياتية بانها الاسس العلمية والهندسية في العمليات التي تعامل فيها المواد بعوامل حيوية مساعدة لغرض توفير السلع والخدمات . ويرتبط هذا العلم بعدة علوم اخرى مثل الكيمياء التحليلية والكيمياء الحياتية والهندسة الكيميائية والوراثة والحاسبات . غرضها الاساسي الحصول على افضل السبل وتطويرها لغرض الاستخدام الامثل للافعال الايضية للأحياء المجهرية في الصناعة والاقتصاد .
تهدف التقنية الحيوية الى هدفين مركزيين : الاول هو ايجاد احسن عامل مساعد لعملية بايوكيميائية معينه , والثاني هو خلق افضل الظروف البيئية لقيام هذا العامل المساعد بعمله .
يعتبر الكائن الحي المجهري بكامله في معظم الحالات عاملا مساعدا في المعاملات البايوكيميائية وهو اكثر تأثيرا وثبوتا من سواه وذلك بسبب النسبة العالية بين المساحة السطحية لخلاياه و بين حجمها الذي يسهل الاستهلاك السريع للمواد المغذية لدعم السرعات للافعال الايضية والتخليق الحيوي كذلك الاحياء المجهرية المقدرة على القيام بأعداد هائلة من التفاعلات البايوكيمياية وهي تتطبع بسهولة الظروف البيئية المختلفة وبذلك يسهل نقلها من البيئة الطبيعية الى المختبر وتنميتها على مصادر كربونية ونيتروجينية رخيصة الثمن وانتاج مركبات ذات قيمة على المستوى الصناعي والاقتصادي . ان التقنية الحياتية تهتم بالعمليات الايضية المايكروبية بشكل خاص وعلى هذ فأن البحث عن كائنات مجهرية حية منتخبة من الطبيعة وتحوير هذه الكائنات بواسطة الطفرات الوراثية هو اهم ما يشغل ذهن العاملين في هذا المجال . تهتم التقنية الحياتية بتصميم المفاعل الذي يعمل فيه العامل المساعد (الكائن الحي المجهري او انزيماته ) وتوفير الوسائل للمحافظة على الظروف الفيزيوكيميائية كدرجة الحرارة والرقم الهيدروجيني والاهتمام بالطرق الاقتصادية للحصول على المنتوج والتخلص من الفضلات الناتجة من هذه العميلة .
استثمر الانسان التقنية الحياتية منذ الاف السنين في الكثير من المجالات كصناعة المشروبات الكحولية وصناعة الخبز وحفظ الاغذية عن طريق تحويرها بالتخمرات (الاجبان والخل والمخللات واللبن ) وصناعة الصابون من الدهون واستخدام طرق التطبيب البداية ومعاملة الفضلات . ان اكتشاف تقنيات الهندسة الوراثية عن طريق اعادة ارتباط الحامض النووي الديوكسي الرايبوزي DNA
ادى الى تطور كبير في التقنية الحيوية حيث ان هذه التقنيات لا تستعمل لانتاج منتجات موجودة فقط وانما تيسير تحقيق معالجات وعمليات صناعية جديدة . وقد ادى تطور الهندسة الوراثية الى صعوبة في تخمين اي من العلوم الصرفة له اهمية تطبيقية وادى ذلك الى حدوث زخم في بحوث علم الحياة الجزيئي (( Molecular Biology خلال العقود الماضية وقد لعبت الهندسة الوراثية دورا رئيسيا في تقدم التقنية الحياتية .
التخمر Fermentation :
التخمر كلمة مشتقة من الفعل اللاتيني Ferver أي يغلي , حيث يصف تأثير الخميرة على مستخلصات الفواكه والحبوب المنبتة . جاء مظهر الغليان بسبب تكون فقاعات ثنائي اوكسيد الكاربون من خلال الافعال الايضية الهدمية التخمرية للسكريات الموجودة في هذه المستخلصات . ويختلف مفهوم التخمر للعاملين في حقل الكيمياء الحياتية عن مفهومه بالنسبة للعاملين في حقل الاحياء المجهرية الصناعية . يعني التخمر بالنسبة للمجموعة الاولى توليد الطاقة بواسطة التأيض الهدمي للمركبات العضوية . اما تعريف التخمر على مستوى الاحياء المجهرية الصناعية فهو اكثر شمولية حيث يعني أية عملية انتاج لمادة مفيدة تتم تحت تأثير الكائنات المجهرية الحية .
ان التمثيل الهدمي للسكريات هو عملية تأكسدية ينتج عنها انتاج بيريدين نكليوتايد
Pyridine nucleotide مختزلة والتي يجب ان تؤكسد ثانية من اجل استمرار هذه العملية في الظروف الهوائية تحدث اكسدة البيريدين نكليوتايد المختزلة بواسطة انتقال الاليكترونات بواسطة نظام الصبغيات الخلوية ( Cytochromes ) الذي يعمل فيه الاوكسجين كمستلم نهائي للالكيترون . اما في الظروف اللاهوائية تكون اكسدة النكليوتايد المختزل مقتربة باختزال مركب عضوي اخر . عند عمل الخميرة على مستخلص الفواكه والحبوب يعاد توليد NADH
عن طريق اختزال حامض البايروفيك pyruvic acid الى ايثانول . تتمكن احياء مجهرية مختلفة من اختزال حامض البايروفيك الى مدى واسع من المنتجات الايضية النهاية اعتمادا على وجود او عدم وجود انزيمات معينة في هذه الكائنات . لا تكون بكتريا حامض اللاكتيك الانزيم
Pyruvate decarboxylase لذا فهي غير قادرة على تكوين منتجات نهائية حاوية على ذرتين من الكاربون مما يؤدي الى تكون حامض اللاكتيك بينما تحتوي الخمائر المنتجة للكحول الاثيلي على هذا الانزيم . ان لدراسة نواتج التخمر اهمية ليس فقط على الصعيد الصناعي و انما على صعيد تشخيص و تصنيف الاحياء المجهرية ايضا , فسلالات بكتريا Lactobacillus مثلا تقسم الى مجموعتين هما
1- مجموعة بكتريا حامض اللاكتيك العضوية متجانسة التخمر Homofermentative Lactobacilli حيث تحوي هذه المجموعة على انزيم Aldolase فعال يقسم سكر الفركتوز ثنائي الفوسفات الى جزيتين من فوسفات السكريات الثلاثية Triose phosphate ويكون الناتج النهائي لهذا المسار هو حامض اللاكتيك فقط .
2- مجموعة بكتريا حامض اللاكتيك غير متجانسة التخمر Heterofrmentative lactobacilli
التي تنتج الايثانول والكليسيرول وحامض الخليك وثاني اوكسيد الكاربون , بالاضافة الى حامض اللاكتيك . ان هذه المجموعة لا تحتوي على انزيم Aldolase لذا فان تكسر جزيئات الكلوكوز يتم عبر مسار السكريات الخماسية من خلال تكوين الرايبولوز الفوسفاتي Ribulose phosphate .
لقد استخدم التخمر الكحولي بفعل الخميرة في الانتاج التجاري لسنوات ماضية وسحيقة في القدم ولهذا وسع العاملون في مجال الاحياء المجهرية الصناعية استخدام مصطلح التخمر ليشمل جميع التفاعلات الكيميائية التي تستخدم فيها الاحياء المجهرية وانزيماتها ويقع ضمنها التفاعلات التي تجري في ظروف هوائية مثل انتاج حامض الكلوكونيك من الكلوكوز بواسطة العفن اسبرجلس Aspergillus niger او انتاج الاسيتون ثنائي الهيدروكسيد من الكليسيرول بوساطة انواع مختلفة من البكتريا التابعة لجنس Acetobacter وانتاج الكتلة الحيوية وانتاج المنتجات الايضية والتحولات البايولوجية وانتاج الانزيمات .










Glucose

Glucose – 6-p

6-p-gluconate

Ribulose – 5 –p+CO2

Acetyl-p glyceraldehyde –p

Acetic acid ethanol pyruvic acid glycerol

Lactic acid


شكل -1- التخمر اللاكتيكي غير المتجانس (Hterolactic Fermentation )
: البحث عن سلالات الكائنات المجهرية الصناعية
يمكن ان تكتشف سلالة جديدة من الاحياء المجهرية الصناعية عن طريق الصدفة كما حصل في اكتشاف المضاد الحياتي البنسلين من قيل العالم الكسندر فلمنك في عام 1929,عدى هذا فهناك طريق منظم للكشف عن سلالة جديدة. توجد مؤسسات خاصة تخزن مزارع الاحياء المجهرية الصناعية تسمى Culture Collection يمكن الرجوع لها لغرض الحصول على سلالات ذات انتاجية معينة. ان هذه المؤسسات يمكن ان تضم كائنات مجهرية ذات صفات معلومة الا انه لا يمكن الحصول منها على سلالات ذات خواص جيدة وانتاجية عالية وعلى هذا الاساس يكون من المفيد جدا عزل الاحياء المجهرية من البيئة الطبيعية بشكل مباشر اذ ان البيئة (التربة و المياه والغذاء و الهواء) تمثل مصدرا غنيا للأحياء المجهرية وكذلك للمواد العضوية المتفسخة. يجب الاشارة هنا الى ان المزرعة التي يتم الحصول عليها من المؤسسات الخازنة للاحياء المجهرية قد تكونا رخص كلفة من تلك التي يتم الحصول عليها من البيئة, الا ان البيئة الطبيعية قد تحتوي على احياء ذات مواصفات انتاجية عالية. ان السلالة معروفة الخصائص التي يتم الحصول عليها من مؤسسات خزن المزارع قد تكون ذات فائدة على الرغم من انتاجيتها المنخفضة اذ يمكن ان تستخدم في التجارب المختبرية التي تتم من اجل تصميم المزرعة واختبار التقنيات المستعملة في قياس وتقدير المادة المنتجة ثم تطبيق النتائج على العزلات الطبيعية.

البحث عن سلالات جديدة :

ان عملية البحث عن سلالات بكتيرية جديدة تعني محاولة اكتشاف انواع مايكروبية جديدة –منتجة للانزيمات المطلوبة وبمستويات عالية بالاضافة الى الصفات الاخرى مثل:- القدرة على النمو في اوساط معينة وتحت ظروف خاصة لانتاج كميات كبيرة في الناتج المطلوب وقد تم اكتشاف هذه السلالات عن طريق الصدفة كما حصل للعالم Fleming عندما عزل بطريق الصدفة الفطر Penicillium- المنتج للمضاد الحياتي البنسيلين والذي لون سطح طبق مزروع ببكتريا Staphylococcus باللون الاخضر , أو عن طريق استخدام تقنيات خاصة بالبحث , هناك طرق مختلفة تستعمل لعزل الاحياء المجهرية واخضاعها للاختبار الاولي لمعرفة قابليتها على القيام بتفاعل معين او انتاج مادة معينة وهي :

1- طريقة الطبق المزدحم Crowded plate technique :
وتتضمن لهذه الطريقة البسيطة التي تستعمل للتحري عن السلالات القادرة على انتاج المضادات الحياتية وذلك عن طريق نشر سلسلة من التخافيف لمعلق التربة على سطح اكار مغذي وتحضن بدرجة حرارة مناسبة ولفترة معلومة , ثم تؤخذ الاطباق التي تحتوي على 100-300 مستعمرة وتغمر في معلق من بكتريا مرضية تسمى test organism يراد البحث عن مضاد حيوي فعال ضدها وتحضن الاطباق مرة ثانية والمستعمرات من معلق التربة التي يظهر حولها منطقة انعدام النمو يتم تنقيتها ودراسة قابليتها على انتاج المضاد الحياتية Antibiotics في مزارع سائلة . يمكن ان تستعمل هذه الطريقة نفسها في الكشف عن الاحياء المجهرية المنتجة لانزيمات تحلل مادة معينه وذلك باضافة هذه المادة الى الوسط الزرعي ثم ملاحظة المتحلل الذي يحدث حول المستعمرات النامية كما يحدث في عزل انواع الجنس Bscillus المنتجة لانزيم alkaline protease حيث تعامل التربة بالبسترة لغرض التخلص من الخلايا الخضرية الموجودة . ثم تنشر التخافيف من عالق التربة هذه على سطح اكار يحتوي على بروتين غير ذائب رقمه الهيدروجيني 9 - 10 . ثم ملاحظة المستعمرات المحاطة بمنطقة دائرية خالية من البروتين غير الذائب . يعطي قطر المنطقة فكرة عن كفاءة السلالة في انتاج هذا الانزيم .
ِ
شكل -2 الكشف عن المضادات الحياتية بطريقة الطبق المزدحم



شكل 3- الكشف عن المضادات الحياتية بطريقة Cross-streak method

2- Auxanography الاوكسانوكرافيه :

هذه الطريقة تستخدم للتحري عن سلالات تنتج عوامل نمو خاصة من التربة وتعتمد هذه الطريقة على وضع شريط من ورقة ترشيح على سطح طبق فارغ بحيث تكون نهايات الشريط حرة من الجانبين ويوضع قرص من نفس ورقة الترشيح على الشريط في باطن الطبق ويصب فوقه وسط أكار مغذي.
وبعد التصلب يصب معلق من التربة بحيث ينتج عنها نمو مستعمرات منفصلة ومعزولة . ومن ناحية اخرى يتم تحضير طبق اخر مزروع بكتريا معينة تسمى Indicator organism.
Indicator organism :- وهي عبارة عن بكتريا فيها طفرة غذائية auxotroph اي ليست لها القابلية على انتاج عامل نمو معين مما يعني انها تحتاج الى اضافة هذا العامل الى وسط النمو مثل حامض اميني او فيتامين غير موجود في الوسط الادنى والذي يسمى minimal medium لذا فالبكتريا لا تنمو على الطبق الا بوجود هذا العامل . وعندما يبرد الطبق الثاني يتم رفع محتويات الطبق الاول ووضعه على سطح الطبق الثاني دون قلبه والمواد الغذائية المنتجة من قبل البكتريا في الطبق الاول تنزل من الطبق الاول الى الثاني بعملية الانتشار diffusion. والمستعمرات التي تحتاج الى عوامل للنمو ستنمو حول المستعمرات بشكل Subculture بين الطبقتين. تعتمد هذة الطريقة بوضع طبق اكار مغذي ونشر عالق مخفف من التربة يعطي عدد قليل من المستعمرات النامية بحيث تكون هذه المستعمرات متباعدة ومفصولة عن بعضها البعض (30-50) ليسهل تشخيصها. ثم يحضر طبق اخر من الاكار المغذي خالي من عامل نمو خاص او حامض اميني او فيتامين. يلقح هذا الطبق بالكائن المجهري الكاشف الفاقد لقدرته على انتاج هذا العامل. ثم ينقل الاكار المغذي من الطبق الاول وبعناية وبطريقة معقمة على سطح الطبق الملقح بالكائن المجهري الكاشف. تنتشر المنتجات الايضية من طبقة الاكار العليا خلال الطبقة الملقحة بالكاشف مما يجعل الكائن المجهري الكاشف ينمو في المنطقة التي تحتوي على عامل النمو المنتج من قبل مستعمرات الاحياء المجهرية في عالق التربة. يعاد استنبات المستعمرات المنتجة وتنقيتها واختبار قدرتها على الانتاج من الناحية الكمية في مزارع سائلة.

1- المزرعة المغناة السائلة Enrichment Liquid culture:

البيئات الطبيعية تضم احياء مجهرية مختلفة لقدرتها على تمثيل المركبات ، وتتعايش هذه الاحياء بفعل قدرة كل نوع على استهلاك جزء من المركبات وقد تكون نواتج تمثيل نوع معين تفيد في نمو نوع أخر. يبقى المجتمع الطبيعي المتوازن حاويا على خليط غير متجانس من الاحياء المجهرية يستخدم كل نوع منها مواد مغذية مختلفة ويستغل الظرف البيئية المختلفة للبية المجهرية Microhabitat ان الغرض من تقنية المزرعة المغناة هي الزيادة في اعداد كائن حي مجهري معين نسبة الى اعداد خلايا بقية الكائنات المجهرية الموجودة في اللقاح المأخوذ من البيئة الطبيعية .لذا اذا زرعت مجموعة احياء في مزرعة تحتوي على مركب واحد اساسي ، مصدر وحيد للكاربون او النتروجين او الطاقة فان الانواع القادرة على استهلاك ذلك المركب ستنمو بسرعة مما يزيد اعدادها في المزرعة. وقد يصاحب نموها نمو انواع أخرى تنمو على نواتج التمثيل ولكن بأعداد اقل، واذا اعيدت عملية الزرع اكثر من مرة فان اعداد النوع الاول ستصبح هي السائدة وبالتالي يمكن عزلها بشكل نقي.




صفات السلالات المهمة في التخمرات الصناعية:-

1- السلالة يجب ان تكون ثابته وراثياً , والسلالة التي تنتج بشكل ثابت وذاتي واحد او اكثر من النواتج المختلفة او غير مطلوية لا تكون هذه السلالة مرغوب فيها.
يجب ان تنتج وبسرعة العديد من الخلايا الخضرية ، السبورات او الوحدات التكاثرية الاخرى.
3- يجب ان تنمو بشده وبسرعة بعد عملية تلقيحها سواء بالمخمر او بالاوعية الخاصة لتحضير اللقاح.
4- يجب ان تكون نقية ليس فقط من باقي الاحياء المجهرية التي يمكن تمييزها مجهرياً وانما خالية من الـ phage .
5- قادرة على انتاج الناتج المطلوب خلال فترة قصيرة ويفضل 3 ايام او اقل.
6- ا يجب ان تنتج الناتج المطلوب دون تكوين مواد سامة من السموم وفي حالة انتاج اكثر من مركب فيجب ان يكون المنتوج المطلوب سهل الفصل عن غيره.
7- الاسpH واطئ او درجات حرارة عالية اوتنتج مواد مثبطة للانواع الاخرى بسرعة.
8- تكون السلالة سهلة الحفظ ولفترات زمنية طويلة.
9- تكون السلالة ذات قابلية على احداث طفرات وراثية مستحثة باستعمال عوامل التطفير وذلك من اجل تحسين صفاتها وزيادة انتاجيتها.
10- السلالة يجب ان تعطي كميات محسوسة من الناتج المطلوب خلال فترة تخمر محددة.

عزل الاحياء المجهرية الصناعية :
يعد عزل الاحياء المجهرية الصناعية اول مرحلة من مراحل استخدامها في التطبيقات الصناعية .يشمل عزل هذه الاحياء الحصول منها على المزارع النقية pure culture او مزرعة مختلطة mixed culture ثم اخضاعها للاختبار لمعرفة اي منها يقوم بالتفاعل المطلوب او انتاج المنتوج المطلوب و يمكن احيانا معرفة قابلية العزلة على الانتاج اثناء عملية العزل وفي احيان اخرى يتم العزل عشوائيا ثم يتم تشخيص العوامل التي تتحكم ها على الانتاج في مرحلة لاحقة .يجب ان تقوم السلالات المعزولة بعملها الانتاجي بشكل يؤدي الى مردود اقتصادي جيد لذا فان اختيار هذه السلالات يتم على اساس قدرتها على الانتاج والكلفة الاقتصادية .

العوامل التي تتحكم في العزل والانتخاب :
1-الصفات التغذوية للكائنات الحية:-
يتطلب العزل في كثير من الاحيان استعمال اوساط زرعية رخيصة وفي احيان اخرى تكون هناك حاجة الى استعمال اوساط ذات مواصفات خاصة وعلى هذا يصمم الوسط الزرعي المستعمل في عزل السلالات. يراعى في هذا الوسط حاجة الكائن الحي المجهري الى مصادر كاربونية ونايتروجينية خاصة او مدعمات نمو خاصة وغيرها من المصادر الغذائية لغرض النمو او لغرض تخليق منتجات معينة.
2 -درجة الحرارة المثلى للكائنات الحية المعزولة:-
يجب ان يكون حضن الاحياء المجهرية في درجة الحرارة المثلى لنمو الكائن المطلوب. ويفضل في التخمرات الصناعية استعمال سلالات احياء مجهرية تكون درجة الحرارة المثلى لنموها اكثر من 40ْ م وذلك لغرض تقليل كلفة التبريد اثناء عملية التخمير على مستوى انتاجي لذا فان عزل الاحياء المجهرية في مثل هذه الدرجات العالية له منافع اقتصادية.
3-توفير الظروف البيئية الملامة في عملية عزل السلالات الصناعية والتي لها الظروف نفسها في حالة تنمية هذه السلالات على المستوى الانتاجي.
4-التاكد من الاستقرار الوراثي للسلالات المعزولة:-
يجب ان تكون السلالات مستقرة وراثيا وقابلة للتطويع الوراثي لغرض تحسين انتاجيتها.
5-التاكد من الانتاجية العالية للسلالات المعزولة من خلال حساب قابليتها على تحويل المادة الاساس الى المنتوج في وحدة الزمن.
6- سهولة استخلاص وتنقية المنتوج من المزرعة.
يمكن اختبار قسم من هذه العوامل والصفات من خلال اخضاع الاحياء المجهرية لعمليات اختبار لاحقة لعملية العزل ويمكن من خلال النتائج تحديد الكائنات المعزولة الاكثر ملائمة من الناحية الاقتصادية والتجارية. وتجدر الاشارة هنا الى تقييم سمية الكائن المجهري او منتجاته قبل استعماله في المخمرات الصناعية من الامور الواجب معرفتها. وتتطلب عملية العزل معرف الصفات المطلوب توفرها في الكائن المجهري المراد عزله من نواحي عديدة كطبيعة الكائن الحي المجهري وطبيعة المادة المراد انتاجها وهل ان الغرض من الحصول على هذه العزلة هو تحسين صناعة تخمرية قائمة او اكتشاف صناعة تخمرية جديدة.