انت هنا الان : شبكة جامعة بابل > موقع الكلية > نظام التعليم الالكتروني > مشاهدة المحاضرة

Purification

التنقية  Purification

 توجد  عدة  طرائق  لتنقية  المنتجات  الحيوية  مثل الإنزيمات والبروتينات وغيرها. تعرف التنقية بانها مجموعة متسلسلة من الخطوات يتحقق من خلالها مجتمعة تنقية الانزيم او البروتين او المنتجات الحيوية الاخرى بصورة سريعة وكفوءة واقتصادية.

تنقية الانزيمات:

يتم تنقية الانزيمات للاغراض التالية:

1- تشخيص وتوصيف الانزيم ويقصد به التحديد الدقيق لصفاته التركيبية والحركية والية التفاعل.

2- التخلص من الانزيمات التي تتداخل مع فعالية الانزيم المطلوب مثل البروتيزات الاخرى التي تتواجد بنفس المستخلص المحتوي على البروتيز القاعدي .

3- التخلص من الالوان والصبغات والروائح  في المنتوج الحيوي مثلا الانزيمات المايكروبية المستعملة في صناعة الجبن والاميلزات المستعملة في تحسين الخبز.

4- انتاج الانزيمات النقية للاغراض التحليلية مثل التحليلات السريرية وتحليلات الاغذية.

5- المقارنة بين صفات الانزيم المستخلص من كائنات حية مختلفة وخاصة في دراسات التطور الجزيئي.

 مستويات التنقية:

تصنف المستحضرات الانزيمية الى ثلاث انواع اساسية حسب درجة نقاوتها :

1- الانزيمات الخام Crude enzymes  عادة تكون مستخلصات خام وتشمل راشح المزرعة في حالة الانزيمات الميكروبية الخارجية.

2- الانزيمات المنقاة جزيئا Partially purified enzymes   وهي الانزيمات المنقاة بفعل خطوة او اكثر من خطوات التنقية التي تكون بطريقة او عدة طرائق الا ان محاليلها لا تزال تحتوي على انزيمات وبروتينات ومكونات خلوية اخرى.

3- الانزيمات عالية النقاوة : وهي المستحضرات الانزيمية المنقاة لغاية التجانس Purified to homogeneity  التي لا تحتوي محاليلها على انزيمات او بروتينات اخرى.

طرائق تركيز الانزيمات والبروتينات

تبرز الاهمية الى تركيز المحلول الانزيمي للتخلص من اكبر قدر ممكن من الماء لزيادة تركيز الانزيم وغالبا ما يتحقق من خلال خطوة التركيز زيادة درجة النقاوة بنسب متفاوتة نتيجة لاختلاف صفات البروتينات. ومن اهم الطرائق هي:

1- الترسيب بفعل الاملاح Salting out  

2- الترسيب بالمذيبات العضوية

3- الترشيح الفائق

4- التركيز بمواد ذات القابلية العالية على امتصاص الماء

1- الترسيب بفعل الاملاح Salting out  

تستخدم الاملاح في ترسيب البروتينات والانزيمات مثل كلوريد المغنيسيوم و كبريتات الامونيوم  و كبريتات الصوديوم وكلوريد الصوديوم , وتعد كبريتات الامونيوم اكثرها شيوعا بسبب:

1- الذائبية العالية لكبريتات الامونيوم التي تبلغ 706 غم / 1000 مل ماء مقارنة بالاملاح الاخرى مثل كلوريد الصوديوم الذي تبلغ ذائبيته 250 غم كلوريد الصوديوم / 1000غم من الماء عند درجة حرارة صفر مئوي.

2- انعدام او قلة تاثير كبريتات الامونيوم على تركيب الانزيم بصورة عامة.

يتم التعبير عن تركيز الامونيوم اللازمة لترسيب بروتين ما بوحدات النسبة المئوية للاشباع ( % Saturation)  وليس التركيز المألوف ( النسبة المئوية وزن / حجم).

ويتم الترسيب باضافة كبريتات الامونيوم باحد طريقتين:

1- اضافة الملح بحالته الصلبة بصورة تدريجية وفقا الى نسبة الاشباع المطلوبة.

2- اضافة الملح بصورة محلول مشبع تدريجيا وفقا الى نسبة الاشباع المطلوبة.

يحدث الترسيب بملح كبريتات الامونيوم للبروتينات بسبب الاخلال Disruption  الذي تحدثه الايونات الملحية بطبقة جزيئات الماء المحيطة بالبروتين أي خفض درجة الذائبية عن طريق تكوين املاح بين ايونات الملح والسلاسل الجانبية للحوامض الامينية المتاينة للبروتين التي تكون اقل ذائبية من البروتين لوحده.

HO^------NH₃ ⁺         COO^------H⁺                     

     H⁺ ----- COO^-                NH₃ ^{+ ----}OH^-   

     H⁺ ----- COO^-                  NH₃ ⁺ ----OH^-

       HO^- -----NH₃ ⁺     COO^- -----H⁺                                             

  اضافة الملح الى   المستخلص البروتيني  

SO₄^=------NH₃ ⁺            COO^------HN₄⁺                      

      NH₄⁺ -----  COO^-               NH₃ ⁺  ----SO₄⁼   

       NH₄⁺ -----  COO^-            NH₃ ⁺

             SO₄ -------            COO^-  -----NH₄⁺           

 2- الترسيب بفعل المذيبات العضوية:

تعتمد على استعمال مذيبات عضوية قابلة للامتزاج بالماء ذات ثابت فصل كهربائي اوطأ من الماء بكثير مما يؤدي الى انخفاض كبير في قيمة هذا الثابت وارتفاع في قيمة القوة التي تجذب الجزيئات الى بعضها البعض وتكوين كتل تترسب من المحلول

3- الترشيح الفائق Ultrafiltration:

من الطرائق المستعملة على نطاق واسع على المستويات المختبرية والصناعية وخاصة في تنقية الانزيمات الميكروبية .وتعتمد الطريقة على استخدام مرشحات جزيئية ذات فتحات محددة تسمح بمرور جزيئات باوزان جزيئية معينة وتمنع الجزيئات الاكبر من المرور, اذ تصنف المرشحات على اساس      Molecular weight cut-off   أي الوزن الجزيئي الذي يمكنه المرور وتباع مرشحات ذات MWCO بين 1000 الى 1000000 . تصنع المرشحات من مواد مشتقة من السليلوز مثل خلات السليلوز ونترات السليلوز كذلك من البولي سلفون وتفضل المصنوعة من البولي سلفون علىالمرشحات السليلوزية  في تنقية الانزيمات بسبب صعوبة تنظيف الاخيرة من البروتينات التي تلتصق بها . ويجري الترشيح تحت ضغط يتراوح بين 25 الى 500 بار/ انج اعتمادا على نوع المرشح والجهاز المستعمل. ويتم توليد الضغط المطلوب اما بوساطة مضخات او بضغط مسلط من اسطوانة النتروجين.

4- تركيز المنتجات الحيوية بوساطة المواد ذات القابلية العالية على امتصاص الماء:

وتتميز هذه الطريقة  بما ياتي:

1- طريقة مفيدة جدا لتركيز الانزيمات الحساسة للاملاح والمذيبات العضوية .

2- كفوءة لتركيز المحاليل ذات الحجوم الصغيرة نسبيا التي لا تتجاوز اللتر.

يتم التركيز بوضع انبوب ديلزة يحتوي على المحلول الانزيمي او المنتج الحيوي في اناء جاف ثم يوضع مقدار مناسب من المادة الممتصة للماء ويترك في الثلاجة مع مراقبة تناقص الحجم وعدم جفاف المنتوج لحين الوصول الى الحجم المطلوب. و من اهم المواد المستخدمة لهذا الغرض هي

Polyethylene Glycol  ( MW 6000 – 20,000  : PEG 6000-20,000) Sephadex G-100; G-150; G-200   (ويمكن اعادة استخدامه بعد تجفيفه بالكحول الاثيلي). مع الانتباه الى حجم مسامات انبوب الديلزة المستعمل اذ يجب عدم دخول PEG  و خروج الانزيم او المنتج الحيوي.

طرائق الفصل المعتمدة على الشحنة

وتشمل:           1- كروموتوغرافيا التبادل الايوني Ion-Exchange Chromatography  

                    2- الترحيل الكهربائي Electrophoresis     

 1- كروموتوغرافيا التبادل الايوني Ion-Exchange Chromatography  

يعتمد الفصل بهذه الطريقة على:

1- الفروقات في كثافة الشحنة    2- الفروقات في توزيع الشحنة

انواع المبادلات الايونية :

1- المبادلات الايونية الموجبة مثل CM-Cellulose  يمتلك المبادل شحنة سالبة ويفصل البروتينات ذات الشحنة الموجبة.    

2- المبادلات الايونية السالبة مثل-Cellulose   DEAE  يمتلك المبادل شحنة موجبة ويفصل البروتينات ذات الشحنة السالبة.

ترتبط البروتينات او المنتجات الحيوية المشحونة مع المبادل الذي يمتلك شحنة معاكسة لشحنة البروتين او المنتوج الحيوي في اس هيدروجيني معين وقوة ايونية معينة بعد اضافة المستخلص المنتوج الخام في عمود المبادل الايوني. ثم يتم غسل عمود المبادل المحتوي على البروتين او المنتوج المرتبط بوساطة دارئ المستعمل في الفصل لازالة جزيئات المواد غير المرتبطة والملوثة للمنتوج  وفيما بعد يتم استرداد المنتوج الحيوي المرتبط بالمبادل باستعمال دارئ اخر ذي اس هيدروجيني مختلف او قوة ايونية مختلفة كما في الشكل التالي .

2- الترحيل الكهربائي Electrophoresis

يعتمد الفصل على:

1- كثافة الشحنة ونوعها        2- شكل الجزيئة    3- الوزن الجزيئي

كروموتوغرافبا  الترشيح الهلامي  Gel Filtration Chromatography

اساس هذه الطريقة هو استعمال مواد ذات مواصفات محددة بهيئة حبيبات كروية Beads ذات فتحات Pores متجانسة الاقطار تسمح بمرور اوزان جزيئية محددة خلالها ويتم الفصل اساسا بتأثير متداخل بين حجم الجزيئة أي وزنها الجزيئي وشكل الجزيئة. واهم انواع مواد الترشيح الهلامي هي Sephadex ; Sephacryl; Sepharose . يتم تحضير الهلام حسب مواصفات الشركة المصنعة ثم يتم تعبئته باعمدة خاصة وباحجام معينة حسب نوع المنتوج الحيوي المراد فصله.

كروموتوغرافيا الميل  Affinity Chromatography

تعتمد  الطريقة على تخصص الانزيمات والبروتينات الفعالة بايولوجيا كاساس الفصل ويتطلب نجاحها توفير المستلزمات التالية:

1- المادة الساندة Matrix   غير ذائبة ذات اشكال هندسية محددة خالية من اية مجاميع مشحونة قد ينشا عنها ارتباطات ايونية  لا نوعية ويعد الهلام Sepharose Cl-4B  من اكثر المواد المستعملة في هذا المجال.

2- مادة ترتبط بالموقع الفعال ارتباطا متخصصا تعرف بالـ Ligand  يتم تثبيتها تساهميا بالمادة الساندة ومن هذه المواد المثبطات التنافسية او المرافقات الانزيمية وغيرها

3- ترتبط المادة الفعالة  Ligand  بحبيبات المادة الساندة خلال جزيئة فاصلة لتحاشي تأثيرات وإعاقة الارتباط الناجمة عن الربط المباشر على الحبيبة

4- تعبأ مادة الفصل الكاملة في العمود تتم موازنته بالمحلول المنظم ذو رقم هيدروجيني مساو الى الرقم الهيدروجيني الامثل للارتباط بالانزيم أي الامثل للفعالية الانزيمية.

5- يتم استرداد الانزيم المرتبط بالعمود باحد الاساليب اما بتغير الرقم الهيدروجيني او تغير القوة الايونية .

او الاسترداد بواسطة محلول التفاعل او المرافق الأنزيمي او المثبط التنافسي (محلول المادة الفعالة المثبتة على العمود في العديد من الحالات).

6- لا تتطلب الطريقة استخدام اعمدة كبيرة الحجم بسبب التخصص العالي للارتباط.