التحري عن البكتريا المرضية في المياه
Detection of Pathogenic Bacteria
إن أكثر الأحياء المجهرية المرضية المهمة الشائع وجودها في المياه خاصة مياه المجاري , والمياه الجوفية والسطحية هي السالمونيلا Salmonella و Shigella و E. coli المرضية والحلزونيات Leptospira والرواشح المعوية Enteric viruses , وقد تستطيع يرقات الديدان الكلاّبية (Hook worm larvae) والكيسيات Entamaeba histolytica وغيرها من الطفيليات الحيوانية من الوصول إلى مياه الآبار في بعض الأحيان , ومن أهم الأنواع المرضية الممكن وجودها في المياه هي Vibrio cholerae و Salmonella ولا توجد طريقة وحدة للتحري عن هذه البكتريا , أما التحري عن الرواشح فهو يتحدد في المختبرات المجهزة بالظروف واللوازم الخاصة بذلك .
يضع البعض أهمية خاصة لاختبارات التحري عن بكتريا القولون لما لها من علاقة بالبكتريا المرضية , أي إنه من الممكن عزل بكتريا مرضية في حالة وجود بكتريا القولون لذا فهذا الاختبار مهم دائماً .
تأتي البكتريا والفطريات المرضية إلى المياه من مياه الفضلات البيتية بصورة رئيسية , ومعظمها لا يستطيع البقاء فترة طويلة إذ سرعان ما تموت خاصة في مياه البحار والمحيطات , ولكن يمكن أن تبقى أنواع مختلفة من هذه الأحياء , ولذا فإن المياه المحملة بفضلات المجاري تعتبر مصدراً خطراً للإصابة بالأمراض خاصة عند وجود الأحياء المعوية المرضية مثل S. typhi و S. paratyphi , ويمكن أن تنتقل هذه البكتريا إلى الإنسان عند أكل السمك أو المحار الملوث بها , وتسبب V. cholerae وباء الكوليرا خاصة في المناطق الأستوائية , وقد توجد هذه البكتريا في المياه دون وجود تلوث برازي , وفي بعض الأحيان توجد بكتريا السل , وسبورات بكتريا الكلوستريديا خاصة تلك التي تسبب الموات الغازي (Gas gangrene) , هذه يمكن أن تبقى فترة طويلة في ترسبات المياه كما يمكن أن توجد البكتريا المسببة للجمرة الخبيثة B. anthrax .
أما بالنسبة للفطريات فقد توجد Candida albicans في المياه المحملة بفضلات المجاري إضافة إلى الفطريات المسببة للأمراض الجلدية (Dermatophytes) التابعة لمجموعة الفطريات الناقصة , وإضافة للبكتريا والفطريات تحوي مياه المجاري رواشح مرضية للإنسان تبقى فعالة في هذا المحيط فترة من الزمن والمياه الملوثة يمكن أن تسبب الإصابة بـ Polimyelitis وكذلك الإصابات المعوية Viral intestinal infection .
عزل بكتريا القولون البرازية المرضية Isolation of Enteropathogenic E. coli
عزلت بكتريا E. coli المرضية من مياه الشرب ومياه الشلالات وهي لا تشبه E. coli الاعتيادية لأنها تكون مرضية , وتنتقل عن طريق المياه , وتحدث الإصابة بها على الأغلب في الأطفال الرضع .
الطريقة :
1. تؤخذ نماذج مياه مختلفة : ماء شرب , نهر , بئر , ينابيع , مجاري , خزان راكد .
2. يرشح حجم معين من نموذج الماء على أن لا يقل عن 50سم3 لمياه الشرب خلال واحد أو أكثر من المرشحات الغشائية بحيث لا يعطي النمو أكثر من 400 مستعمرة , وينقل المرشح إلى الوسط الغذائي (MFC) ويحضن بدرجة 35 - 37?م لمدة 20 - 22 ساعة وتعد المستعمرات التي تعطي لمعة معدنية .
3. تنقى المستعمرات ويجري لها اختبارات IMVIC (الأندول وأحمر المثيل والفوكس بروسكور واستهلاك السترات) وتعطي هذه البكتريا النتيجة - - + + (موجب موجب , سالب سالب) لهذه الاختبارات كما إنها تكون غاز من تخمر اللاكتوز وتجرى لها الاختبارات المصلية (Serological test) لغرض تشخيصها .
عزل وتشخيص السالمونيلا والشيكلا
Isolation and Identification of Salmonella and Shigella
بكتريا السالمونيلا عصيات سالبة لصبغة كرام , لا تكون سبورات متحركة بأسواط محيطية تكون كبريتيد الهيدروجين (H2S) ,معظمها لا يخمر سكر اللاكتوز , قد تسبب الإصابة بالتسمم السالمونيلي عند تناول الأغذية والمشروبات الحاوية عليها .
تتميز السالمونيلا عن بقية أفراد عائلة Enterobacteriaceae (التي تنتمي إليها) بأنها متحركة ولا تكون محفظة , وهي تشبه عظم البكتريا المعوية الأخرى في المزروع (على الأوساط الزرعية) عدا إنها عندما تنمو على وسط ماكونكي أو وسط (DCA) لا تخمر سكر اللاكتوز خلال 18 - 24 ساعة , ومستعمراتها شاحبة , ويمكن تمييز السالمونيلا عن الشيكلا باختبارات بسيطة وذلك بأن الأولى تكون غاز وحامض عند تنميتها في محاليل سكرية إضافة إلى إنها متحركة وتكون H2S في الغالب معظمها ليست له القابلية على إنتاج الأندول .
لا توجد طريقة قياسية واحدة لعزل السالمونيلا والشيكلا , وإنما هناك عدة طرق تستعمل لمعرفة وجودها في المياه , وتختلف السالمونيلا اختلافات كثيرة في السلالات والظروف الخاصة بنموها , ولذا لا تعني النتيجة السالبة لأي طريقة من الطرق المستعملة عدم وجودها أو عدم وجود كائنات مرضية أخرى , وبصورة عامة من الضروري اختبار عينات كبيرة لعزل الأحياء المرضية لأنها توجد بأعداد قليلة مقارنة ببكتريا القولون .
تحدث الإصابة بالشيكلا أيضاً عن طريق الأطعمة والمشروبات وتنتقل إلى الأمعاء الغليظة وتبدأ بالتكاثر وتسبب الإصابة بالدزنتري المصحوب بالإسهال مع دم ومواد مخاطية والآم في البطن واضطرابات عصبية .
الطريقة :
تؤخذ نماذج مياه مختلفة : ماء نهر , مجاري , شرب , ينابيع , آبار .
1. التنمية في الأوساط الاختيارية Growth in Selective Media
لفصل الأحياء المرضية من غير المرضية العامة يمكن استخدام درجات حضانة مناسبة للوسط الإغنائي الأول , ثم تمييزها باستعمال الوسط الاختياري , وهذين العاملين أي درجة الحرارة والوسط الاختياري لها علاقة مع بعضها , ويمكن الحصول على معظم أنواع السالمونيلا بدرجة 37?م باستعمال وسط Bismuth sulfite agar أكثر من بقية الأوساط , كما إن درجة 41,5?م لوسط Brilliant green يقلل عدد الأحياء الأخرى إلا أن بعض سلالات السالمونيلا لا تنمو في هذه الدرجة المرتفعة .
يمكن تصنيف الأوساط الصلبة المستعملة لعزل الأحياء المرضية هذه إلى ثلاثة :
أ - الوسط التفريقي Differential Medium
الذي يحوي قليل أو لا يحوي مواد مثبطة للبكتريا غير مرضية مثل وسط (EMB) (الذي يحوي سكروز) ووسط ماكونكي (Macconkey agar) .
ب - الوسط الاختياري Selective Medium
الذي يحوي على صبغة الأخضر البراق (Brilliant green) مثل وسط (Brilliant green agar) أو وسط Bismuth sulfite agar , والوسط الأول نموذجي لعزل السالمونيلا حيث تظهر مستعمراتها بيضاء وردية مع خلفية حمراء , وتنمو S. typhi وأنواع أخرى بصورة ضعيفة على هذا الوسط بسبب وجود صبغة الأخضر البراق , وتظهر الأنواع المخمرة لسكر اللاكتوز (التي لا يتثبط نموها) بشكل مستعمرات خضرة , أو تنتج ألواناً أخرى بمرور الزمن , وقد تنمو بعض الأحياء المخمرة للاكتوز ببطء (مثل Pseudomonas و Proteus و Citrobacter) ومستعمراتها تشبه مستعمرات البكتريا المرضية , فترة الحضانة في هذا الوسط 48 ساعة للسماح بنمو أي كائنات مرضية بطيئة النمو .
أما بالنسبة للوسط الثاني (Bismuth sulfite) فهو يعطي نمواً جيداً لعدة أنواع من السالمونيلا بضمنها S. typhi وفترة الحضانة 48 ساعة . المستعمرات النموذجية للسالمونيلا على هذا الوسط تعطي لوناً أسوداً بلمعة معدنية او بدونها وقد تمتد لتكون هالة سوداء حول المستعمرة , بعض الأنواع تكون مستعمرات خضراء , وقد تنمو معها بعض المستعمرات البكتريا المكونة لكبريتيد الهيدروجين مثل Proteus .
جـ - الأوساط الاختيارية الحاوية على أملاح الصفراء
مثل وسط XLD أو وسط Desoxycholate citrate agar أو وسط S. S agar . ويستعمل وسط XLD لتنمية الشيكلا بعد نموها في وسط GN وتظهر مستعمراتها على هذا الوسط حمراء , وتظهر مستعمرات السالمونيلا و Arizona ذات مركز أسود أما بكتريا القولون و Proteus و Citrobacter فتكون مستعمرات صفراء . فترة الحضانة المثالية 24 ساعة وإذا طالت يصبح الوسط قاعدياً وأكثر أسوداداً نتيجة تكون (H2S) من قبل البكتريا غير المرضية .
من المفروض استعمال عدة أوساط أختيارية للحصول على أكثر ما موجود من أنواع هذه البكتريا في المياه ولأن الوسط الذي يصلح لنمو السالمونيلا قد لا يصلح للشيكلا .
4. الفحوصات الفسلجية لتشخيص الأنواع (Biochemical Tests)
تستعمل عدة اختبارات لتشخيص الأنواع المعزولة مثل اختبار تخمر السكريات وتحلل اليوريا والنمو على وسط T.S.I وغيرها إضافة إلى الفحوصات المصلية (Serological Tests) .
عزل بكتريا الكوليرا Vibrio Cholerae من المياه :
وهي عصيات قصيرة منحنية ، سالبة لصبغة كرام ، متحركة بسوط قطبي ، تنمو بتركيز أيون هيدروجين يتراوح بين 6- 9 إلا إنها تفضل المحيط القاعدي ، لا تكون محفظة (Capsule) ولا سبورات ، تخمر السكريات ولا تكون غاز ، توجد في المياه العذبة والمالحة وأمعاء الإنسان والحيوان . تسبب مرض الهيضة (الكوليرا) ، ومن أهم عوامل انتشار المرض المياه والأغذية الملوثة بها ، ويسبب المرض إسهالاً غزيراً مؤدياً إلى فقدان سوائل الجسم بكميات كبيرة وقد يؤدي إلى الموت .
الطريقة :
تؤخذ نماذج مختلفة من المياه : ماء نهر ، شرب ، ينابيع ، آبار ، مجاري .
1. التنمية في الأوساط الاغنائية :
أ- يضاف 100سم3 من نموذج الماء إلى 10سم3 من الوسط الاغنائي الأول (ماء الببتون القاعدي مضاعف عشر مرات وتحضن بدرجة 37?م لمدة لا تزيد عن 18 ساعة لأن الحضانة الطويلة تؤثر على البكتريا هذه لتغير دالة حموضة الوسط وتثبط نمو البكتريا (تنخفض دالة حموضة الوسط عند نمو البكتريا مما ينعكس بصورة سلبية عليها) .
ب- يؤخذ 2سم3 من سطح المزرعة السابقة بعد نمو البكتريا ويضاف إلى وسط الاغناء الثاني (ماء الببتون القاعدي) ، ويحضن بدرجة 37?م لمدة 6 ساعات .
2. الزرع على الوسط الاختياري :
يؤخذ من سطح المزرعة الثانية ويخطط على الوسط الاختياري (TCBS) ، وتحضن الأطباق بدرجة 37?م لمدة 18 ساعة ، ثم نلاحظ مستعمرات بكتريا Vibrio التي تكون دائرية الشكل قطرها 1- 3 ملم محدبة ناعمة ملساء الحافة مخمرة للسكروز فتظهر صفراء اللون نتيجة التخمر وتغير لون الدليل الموجود في الوسط (وهو Bromothymol Blue) بفعل الحامض المتكون وقد تنمو بعض أنواع بكتريا القولون و Proteus والمكورات المعوية (Enterococci) إلا إن مستعمراتها تكون صغيرة وشفافة عادةً وهناك أنواع من Proteus تخمر السكروز فتظهر صفراء وبذلك تشبه مستعمرات Vibrio ، وقد تظهر Pseudomonas و Aeromonas مكونة مستعمرات زرقاء اللون عادة .
3. فحص البكتريا النامية :
تحضر مسحة من المستعمرات التي من المتوقع أن تكون Vibrio وتصبغ بصبغة كرام وتفحص بالمجهر للتأكد من شكل الخلايا حيث تكون عصيات منحنية سالبة لصبغة كرام .
4. التشخيص :
لتشخيص أنواع هذه البكتريا تعمل لها الفحوصات الفسلجية (البايوكيمياوية) مثل تخمر المانيتول ، والنمو على وسط TSI والكشف عن الأندول وغيرها .
عزل الحلزونيات المرضية من المياه Isolation of Pathogenic Leptospires
يختلف وجود الحلزونيات في المياه الطبيعية ، وهناك صعوبة في الحصول عليها حيث تؤثر عدة عوامل عليها مثل سرعة الجريان وتركيز أيون الهيدروجين ، وتوفر المواد الغذائية وغيرها ... والظروف الملائمة لها هي وجود مواد غذائية معتدلة (عادةً البكتريا) ، وتركيز لأيون الهيدروجين 6- 8 ، ومياه دافئة ذات جريان بطيء ، وفيما لو وجدت فإن التحري عنها صعب بسبب منافسة الكائنات الأخرى لها ، وفي حالة عدم الحصول على نتائج إيجابية فإن ذلك لا يعني بالضرورة عدم وجودها ، وهي تحتاج إلى أوساط مختلفة لأنها بطيئة النمو ، وعندما تعزل تجري لها الفحوصات الفسلجية والمصلية للتمييز بين الأنواع المرضية والرمية .
الطريقة :
تؤخذ نماذج من مياه نهر من مناطق مختلفة ، مياه مجاري ، ماء راكد ، ماء ساقية ، ماء بئر.
1. التركيز الأولي :
تتركز الحلزونيات في قعر النهر قرب الحافة لذا تحرك المياه قبل أخذ النماذج للحصول على الحلزونيات العالقة في المياه ، وفي المختبر يرج النموذج لتحرير البكتريا من الرواسب ، ويرشح مباشرة خلال ورق ترشيح (Whatman No.1) أو خلال Membrane Filter Absorbent Pad ، ثم يمرر الراشح خلال Swinney Hypodermic Adapter يحوي مرشح من صوف زجاجي أو مرشح غشائي (0,45 مايكرون) لفصل الحلزونيات (عن غيرها) التي تستطيع أن تمر خلال هذه الثقوب .
2. الاغناء Enrichment
يزرع جزء من الراشح (1- 0,1 سم3) في وسط Fletcher Semisolid Medium الحاوي 10? مصل الأرنب وتحضن لدرجة 30?م لمدة 6 أسابيع ، وتفحص أسبوعياً للتأكد من نمو الحلزونيات وعدم التلوث ، وذلك بعمل حقل مظلم عند الفحص Dark Field Illumination ، وأكثر الأنواع التي قد تلوث المزروع والتي يمكن ملاحظتها هي Paraspirillum و Vibrio و Spirillum خاصةً عندما يكون الحجم المأخوذ من المياه أكثر من 0,1 سم3 .
تلاحظ Leptospires ملتفة بشكل حلزوني (Helicoid) طولها 6- 20 مايكرون ، قطر اللفات 0,2-0,3 مايكرون وهذه اللفات مضغوطة أكثر مما في الحلزونيات الأخرى ، وإذا لم تلاحظ هذه الحلزونيات خلال ستة أسابيع يعتبر الاختبار سالب .
3. تشخيص الحلزونيات المرضية Idenfication Of Pathogenic Leptospires
يدل وجود الحلزونيات المرضية في مياه الأنهار والبحيرات على إصابة الحيوانات التي تتردد على هذه المياه بمرض (Leptospirosis) مما يشكل خطورة على السابحين في مثل هذه المياه ، ومن المهم التمييز بين الحلزونيات المرضية والرمية بما يلي :
أ- تفاعلات المزرعة Culture Reactions
تنمو الحلزونيات الرمية جيداً في وسط ستوارت (Stuarts Medium) الحاوي 10? مصل الأرنب و 10 مايكرو غرام/سم3 كبريتات النحاس كما أن الأنواع الرمية فقط هي التي تنمو في الوسط الحاوي 10? مصل الأرنب بدرجة 13?م ، وهي التي تعطي تفاعلاً إيجابياً واضحاً لفحص الأوكسيديز (Oxidase) وتحلل صفار البيض أكثر من المرضية ، إن الدرجة المثلى لنمو الأنواع المرضية هي 30?م وفترة الحضانة 5 أيام لجميع الاختبارات ، ولا يوجد فحص واحد يفرق بين الرمية والمرضية .
ب- التأكد من الناحية الأمراضية Verification Of Pathogenicity
يمكن تشخيص الحلزونيات المرضية بواسطة المصول المناعية وهي متوفرة ، وأخيراً تجرى لها اختبارات الحقن في الحيوانات المختبرية وهذه تعمل من قبل متخصصين في هذا المجال .