الفحوصات البكتريولوجية المهمة للمياه (خاصة مياه الشرب)
العد الكلي للبكتريا والتحري عن التلوث البرازي في المياه :
من المهم معرفة أنواع الأحياء المجهرية الموجودة في المياه خاصة عند استعمال هذه المياه للشرب أو الصناعات الغذائية لأنها قد تحتوي أحياء مرضية نتيجة تلوثها بمياه المجاري أو الفضلات البرازية وتؤدي إلى الإصابة ببعض الأمراض عند استعمالها خاصة الأمراض المعوية مثل التيفوئيد والدزنتري كما أن المياه التي تحوي عدداً كبيراً من الخلايا الحية , وإن لم يكن فيها تلوثاً برازياً أو بكتريا مرضية تعتبر غير مرغوبة خاصةً في الصناعات الغذائية لأنها تكون سبباً في فساد الأغذية .
إن التلوث البرازي للمياه يعني وجود أحياء تأتي من الأمعاء مثل E. coli و Streptococcus faecalis و Clostridium perfringens ومن المحتمل أن تحوي بكتريا معوية مرضية مثل Salmonella و Vibrio cholerae ومن الضروري أن لا يحوي ماء الشرب على هذه البكتريا المرضية . أن وجود E. coli البرازية في المياه يدل على تلوث برازي حديث , أما S. faecalis فهي ليست بكفاءة E. coli من ناحية كونها دليل على التلوث البرازي لأنها سرعان ما تهلك إلا إنها في بعض الأحيان تبقى فترة طويلة (عند توفر الظروف الملائمة لها) . وتستطيع بكتريا C. perfringens من البقاء فترة طويلة في المياه أكثر من S. faecalis و E. coli وهي تستخدم كدليل على التلوث البرازي في حالة عدم وجود هذين النوعين من البكتريا .
الاختبارات التي يجب إجراءها للمياه المذكورة تتضمن حساب العدد الحي للبكتريا بدرجة 22 و 37?م للتعرف على مدى التلوث ومصدره إضافة إلى اختبار التحري عن التلوث البرازي والبكتريا المرضية .
العد الحي العام للبكتريا :
تتبع طريقة صب الأطباق في عزل وتعداد البكتريا وتقارن أعداد البكتريا في النماذج المختلفة للمياه المأخوذة بجداول خاصة بالأعداد القياسية للبكتريا المسموح بها لمعرفة صلاحية هذه المياه للاستهلاك البشري .
التحري عن التلوث البرازي للمياه :
Detection of Faecal Pollution
عزل وعد بكتريا القولون والقولون البرازية :
مجموعة البكتريا القولون عصيات سالبة لصبغة كرام غير مكونة للسبورات تخمر سكر اللاكتوز مكونة حامض وغاز . إن البيئة الطبيعية لهذه المجموعة من البكتريا هي أمعاء الإنسان أو الحيوانات لذا تتخذ كدليل على تلوث المياه بالفضلات البرازية عند وجودها وبذلك تعطي احتمال وجود بكتريا معوية مرضية في مثل تلك المياه ومن هذا يتبين أهمية فحص وجود بكتريا القولون في المياه .
الطريقة الأولى :
1. تؤخذ نماذج مياه مختلفة : ماء نهر ، شرب ، راكد ، بئر ، ينابيع ، مجاري .
2. تستعمل طريقة العد الأكثر احتمالا M.P.N وتستعمل التخافيف 210 ، 10 ، 10 صفر ، 10-1 ويتم التلقيح كالآتي :
أ - يلقح 100 مل من الوسط الزرعي مضاعف التركيز (وسط اللاكتوز) و100 مل من عينة الماء بشكل 3 أو 5 مكررات ( أي 3 أو 5 دوارق تحوي 100 مل من الوسط السائل) .
ب – يلقح 10 مل من الوسط الزرعي (مضاعف التركيز) بـ10 مل من نموذج المياه بشكل 3 أو 5 مكررات .
3. يلقح 10 مل من الوسط أحادي التركيز بـ1 مل من الماء أيضاً بـ 3 أو 5 مكررات .
4. يلقح 10 مل من الوسط أحادي التركيز بـ1 مل من تخفيف 1-10 *** بثلاث أو 5 مكررات .
5. تحضن الأنابيب بدرجة حرارة مناسبة (35 – 37 ?م) ويسجل عدد بكتريا القولون الفرضي بعد حساب عدد الأنابيب الموجبة (التي يظهر فيها نمو ويتكون غاز في أنبوبة درهم) في كل مجموعة من المجاميع السابقة والرجوع إلى جداول M.P.N ثم يزرع من كل أنبوب أعطى نتيجة موجبة في أنبوب آخر يحوي نفس الوسط الزرعي ويحضن بدرجة 5و44?م وكذلك في أنبوب يحوي ماء الببتون (فحص الأندول) ويحضن أيضاً بدرجة 5و44?م وذلك للتأكد من وجود بكتريا القولون البرازية E. coli التي تستطيع النمو بهذه الدرجة المرتفعة .
ملاحظة : إذا كان الماء ملوثاً تحضر تخافيف أعلى وتستعمل للتلقيح .
الطريقة الثانية :
(الطريقة القياسية لتعداد بكتريا القولون العكسي باستعمال M.P.N ) .
1. الفحص الفرضي Presumptive Test
تلقح سلسلة من الأنابيب بشكل ( 3 أو أربع مجاميع كل مجموعة تحوي 3 أو 5 أنابيب) تحوي وسط Lauryl Broth أو وسط Brillint Green Bile Lactose Broth بحجم معين من عينة الماء الأصلية ( من الأفضل أن يكون الحجم 100 أو 10 أو 1 أو 1و0 أي تخافيف عشرية) وترج الأنابيب وتحضن بدرجة 37?م لمدة 24 ساعة ويلاحظ تكون غاز في نهاية هذه المدة وإذا لم يتكون غاز تترك الأنابيب 48 ساعة في الحاضنة وعند تكون الغاز خلال هذه المدة تعتبر النتيجة موجبة ولكي لا يحدث التباس بين الفقاعة الغازية المتكونة في أنبوبة درهم نتيجة تخمر السكر من قبل البكتريا وبين أي فقاعة غاز قد تكون موجودة يلاحظ تضبب الوسط الزرعي مما يدل على نمو البكتريا وإنتاجها الغاز نتيجة التخمر .
2. الفحص التأكيدي Confirmed Test
ينقل قليل المزروع الذي أعطى نتيجة موجبة في الفحص الفرضي إلى أنابيب تحوي وسط Brillint Green Bile Lactose Broth بواسطة الناقل المعقم وتحضن بدرجة 37?م لمدة 48 ساعة وعند تكون أي كمية من الغاز في الأنابيب تعتبر النتيجة موجبة للفحص التأكيدي .
3. الفحص التكميلي Complete Test
وهي الخطوة التي تتبع الفحص التأكيدي حيث يأخذ جزء من المزروع من كل أنبوب أعطى نتيجة موجبة من الفحص السابق ويخطط على وسط Endo Agar أو E.M.B Agar وبالسرعة الممكنة بعد ظهور الغاز وتحضن الأطباق بدرجة 37?م وتلاحظ المستعمرات النموذجية التي تكون ذات مركز ولمعة معدنية خضراء أو بدونها . أما المستعمرات غير النموذجية ستكون معتمة غير مركزية مخاطية وردية بعد 24 ساعة من الحضانة .
فحص Eijkman Test
ينقل جزء من المزروع من الأنابيب التي أظهرت نتائج موجبة في الفحص الفرضي لبكتريا القولون إلى وسط لاكتوز جديد (أنابيب لاكتوز) وتحضن في حمام مائي على درجة حرارة 44,5?م لمدة 24 ساعة وتلاحظ النتيجة الموجبة عند تكون غاز مما يدل على أن بكتريا القولون البرازية لأن عند هذه الدرجة لا تنمو إلا E. coli ذات النمط البرازي (Fecal Type) التي مصدرها أمعاء الإنسان والحيوانات ذات الدم الحار كذلك تستطيع E. coli النمط البرازي أنتاج الأندول عند هذه الدرجة .
الطريقة الثالثة :
طريقة الترشيح لتعداد بكتريا القولون العكسي
Membrane Filter Technique for Enumeration of Coliform
1. يرشح حجم مناسب من نموذج الماء , وكلما كان الماء أقل تلوثاً كلما كان حجم الماء المرشح أكثر فلمياه الشرب أو الآبار أو الينابيع مثلاً يأخذ 100 مل أو أكثر ولمياه الأنهار 10 مل أو 1 مل أو 0,1 مل وهكذا ويستعمل مرشح غشائي قطر ثقوبه 0,45 مايكرون .
2. يرفع المرشح الغشائي بعد الانتهاء من الترشيح بملقط معقم ويوضع على الوسط الزرعي Endo Agar مثلاً مع حركة دائرية لقرص الترشيح لكي لا تحدث فقاعة هوائية بين القرص وسطح الوسط ويراعي أن تتم العملية في ظروف معقمة .
3. تحضن الأطباق بدرجة 37?م لمدة 20 – 22 ساعة .
4.
تلاحظ المستعمرات النامية حيث تظهر مستعمرات بكتريا القولون النموذجية (على وسط Endo Agar وE.M.B Agar) بلون وردي أو أحمر داكن مع لمعة معدنية في وسطها وتعد هذه المستعمرات وتؤخذ الأطباق الحاوية 20 – 80 مستعمرة ويجب ألا تزيد عن 200 مستعمرة للمرشح الواحد ويحسب عددها في 100 مل من الماء كما يلي :
العدد الكلي لمستعمرات بكتريا القولون / 100 مل = ??????????
إذا كان عدد المستعمرات كبيراً يفضل إعادة الترشيح ويؤخذ حجم أقل من النموذج .
عزل وعد بكتريا القولون البرازية
Isolation And Enumeration Of Faecal Coliform
تستعمل اختبارات معينة تتضمن حضن المزارع بدرجات حرارية عالية لتفريق بكتريا القولون التي يكون مصدرها البراز عن تلك التي لا يكون مصدرها البراز وبتحويرات عديدة وتستعمل طريقة M.P.N أو طريقة الترشيح والطريقة الثانية تعتبر من الطرق الملائمة للتفريق بين بكتريا القولون البرازية وغير البرازية ويمكن تطبيقها على مياه مختلفة كمياه الشرب والأنهار والبحار والمسابح وغيرها ....
الطريقة :
1. تؤخذ نماذج مختلفة من المياه : ماء شرب , نهر , بئر , ينابيع , خزانات , مجاري . ويجرى لها الفحص القرصني لبكتريا القولون .
2. ينقل جزء من المزروع من الأنابيب التي أظهرت نتائج موجبة في الفحص الفرضي لبكتريا القولون إلى وسط EC agar , وترج جيداً .
3. تحضن الأنابيب بدرجة 45,5?م ± 0,2 لمدة 24 ساعة .
4. تلاحظ النتيجة الموجبة عند تكون غاز في الأنبوبة الصغيرة خلال 24 ساعة مما يدل على أن البكتريا برازية .
عزل وعد بكتريا المسبحيات البرازية Fecal Streptococci
تقع هذه المسبحيات ضمن مجموعة (D) حسب تصنيف (Lancefield Group D Streptococcus) وتعتبر دليل على التلوث البرازي للمياه وتشمل العديد من الضروب والأنواع مثل :
S. faecalis var. liquefaciens
S. faecalis var. zymogenes
S. faecium
S. equines
S. bovis
توجد هذه المسبحيات في أمعاء الإنسان والحيوان وعلى الحشائش والتربة وبعض الحشرات . إن الاعتماد على هذه البكتريا لوحدها كمؤشر على التلوث البرازي ذو أهمية قليلة ، لكن وجودها مع بكتريا القولون والقولون البرازية يؤكد المصدر البرازي للتلوث مع طول مدته ، وبذلك يمكن استعمال هذه البكتريا مع بكتريا القولون البرازية لمعرفة مصدر التلوث سواء كان من الحيوان أو الإنسان حيث وجد إن بكتريا القولون البرازية Fecal Coliform (Fc) في براز الإنسان يفوق عدد المسبحيات البرازية (Fs) Faecal Streptococci لذا اتخذت النسبة Fc/Fs لمعرفة مصدر البراز ، فعندما تكون النسبة 4/1 يكون مصدر التلوث هو الإنسان أما لو كانت 0,6/1 فمصدر التلوث هو الحيوانات ذات الدم الحار .
تمتاز S. faecalis باحتياجاتها الغذائية المعقدة ولها مدى حراري واسع النمو , ومدى واسع لتراكيز أيون الهيدروجين (pH) أكثر من بكتريا القولون وترتبط S. faecalis و S. faecium بفضلات الأنسان أما S. bovis و S. equinus فتأتي من فضلات الحيوانات , ومصدر السلالة S. faecalis var. liquifaciens عادة من التربة والنباتات والحشرات .
الطرق :
الطريقة الأولى : طريقة الأنابيب المضاعفة (M.P.N)
أ- الفحص الفرضي Presumptive test
تستعمل نفس طريقة التلقيح السائل المستعملة لبكتريا القولون باستخدام وسط الأزايد والدكستروز السائل (Azide – dextrose broth) المضاعف التركيز للحجوم الكبيرة (10 سم3 فما فوق) وأحادي التركيز للحجوم الصغيرة (1 سم3 أو أقل) , واذا كانت العينة ملوثة يؤخذ منها حجوم أقل أو تخفف ويؤخذ حجم مناسب من التخافيف .
تحضن الأنابيب بدرجة 37?م لمدة 24-72 ساعة ويلاحظ النمو الذي يظهر بهيئة عكورة أو تغير اللون (الأحمر أو البنفسجي) إلى الأصفر عند وجود كاشف احمر الفينول أو البروموكريسول في الوسط وتسجل النتيجة موجبة .
ب- الفحص التأكيدي Confirmed test
ينقل من الأنابيب التي أعطت نتيجة موجبة في الفحص الفرضي 3 مرات بواسطة الناقل (3 Loop full) إلى أنابيب تحوي وسط Ethyl violet broth , وتحضن بدرجة 37?م لمدة 24 ساعة , وتلاحظ الأنابيب حيث تظهر النتيجة الموجبة بشكل حلقة أرجوانية اللون في قعر الأنبوبة أو عكورة شديدة ، أما الأنابيب التي تعطي نتيجة سالبة فتلقح مرة أخرى وتحضن 24 ساعة إضافية ، وتحسب الأنابيب التي تعطي نتيجة موجبة ويستخرج عدد البكتريا لكل 100 سم3 من المياه من جداول M.P.N .
ويمكن عمل الفحص التأكيدي أيضاً بنقل جزء من المزروع الذي أظهر نتيجة موجبة في الفحص الفرضي إلى وسط الأزايد والدكستروز (وسط غير مزروع) وتحضن بدرجة 45?م لمدة 48 ساعة .
الطريقة الثانية : طريقة الترشيح Filteration Method
يرشح حجم معين من نموذج المياه (يعتمد حجم النموذج على درجة تلوث المياه) بنفس الطريقة المذكورة لبكتريا القولون ، وينقل قرص المرشح الغشائي إلى وسط KF الصلب ، ويحضن بدرجة 37?م لمدة 24 ساعة .
تظهر مستعمرات المسبحيات البرازية حمراء أو وردية ، وللتأكد منها تؤخذ إحدى المستعمرات وتزرع على مائل وسط Brain Heart Infusion Agar وتحضن بدرجة 37?م لمدة 24 ساعة وعند ظهور النمو يؤخذ جزء منه ويوضع على شريحة زجاجية ، ويضاف لها بضع قطرات من محلول 3? بيروكسيد الهيدروجين (محضر حديثاً) ويدل ظهور الفقاعات على احتمال وجود المسبحيات ، وعدم ظهورها يدل على نتيجة سالبة ، ثم يكمل التأكد منها بنقلها إلى وسط Brain Heart Infusion Broth وتحضن بدرجة 45?م لمدة 48 ساعة ، كما ينقل منها إلى وسط أملاح الصفراء السائل [60 سم3 وسط مستخلص القلب والدماغ Brain Heart Infusion + 40 سم3 من محلول 10? مرارة (أملاح الصفراء) [ Oxgall وظهور نمو في هذا الوسط يدل على نتيجة موجبة .
طرق العزل والتعداد :
1. طريقة الأنابيب المضاعفة (M.P.N)
تؤخذ نماذج لمياه مختلفة : ماء نهر ، شرب ، آبار ، ينابيع ، مجاري ، خزانات ، ساقية ، راكد .
أ- الفحص الفرضي
تبستر عينة الماء في حمام مائي بدرجة 70 – 80?م لمدة 10 دقائق ، وتتبع نفس الخطوات المذكورة في تعداد بكتريا القولون بهذه الطريقة ، ويستعمل وسط DRCM (مضاعف التركيز للحجوم الكبيرة وأحادي التركيز للحجوم الصغيرة كما موضح سابقاً) ، ولتوفير الظروف اللاهوائية لنمو هذه البكتريا يجب أن تملأ القناني تقريباً أي يترك فراغ قليل قرب فوهة القنينة ، وتستعمل قناني أو أنابيب ذات سدادات لولبية ولا تغلق السدادات بأحكام ، ولا تملأ تماماً للسماح للغازات المتكونة أثناء نمو البكتريا بالخروج كي لا تنفجر القنينة من الضغط إذا ما أغلقت بأحكام ، ويمكن إدخال سلك معدني مسخن حتى الإحمرار إلى الوسط لتوفير ظروف لا هوائية (بعد إستهلاك الأوكسجين الموجود في القنينة من قبل السلك المسخن) ، ويجب أن لا ننسى إضافة المحلولين (كبريتيت الصوديوم وسترات الحديد) إلى الوسط قبل تلقيحه .
تحضن القناني أو الأنابيب الحاوية على الوسط الملقح لدرجة 37?م لمدة 48 ساعة ، ويلاحظ تكون اللون الأسود في الوسط نتيجة نمو البكتريا هذه وقيامها بإختزال الكبريتيت الموجود في الوسط وتحوله إلى راسب أسود من كبريتيد الحديد (FeS) والذي يدل على إيجابية الإختبار .
ب- الفحص التأكيدي
يؤخذ قليل من المزارع التي أعطت نتيجة موجبة في الفحص السابق بواسطة ناقل معقم وتلقح في وسط حليب اللتموس وتحضن بدرجة 37?م لمدة 48 ساعة في ظروف لا هوائية (أما بإضافة شمع البرافين أو يوضع سلك مسخن في الأنابيب للتخلص من الأوكسجين أو يملئ الأنابيب بالوسط) ويلاحظ التخمر العاصف (Stormy Fermentation) الذي يظهر في وسط حليب اللتموس بشكل خثرة ترتفع إلى الأعلى نتيجة الغازات المتكون ، ويتحول الوسط إلى سائل شفاف ، يمكن عمل مسحة من هذا الوسط وصبغها لرؤية البكتريا والتأكد منها .