انت هنا الان : شبكة جامعة بابل > موقع الكلية > نظام التعليم الالكتروني > مشاهدة المحاضرة

طريقة المذيبات العضوية Organic solvent Method (المختبر الثاني 2016)

Share |
الكلية كلية العلوم     القسم قسم علوم الحياة     المرحلة 4
أستاذ المادة حسين عليوي مطلب الدهموشي       18/01/2017 13:19:25
المختبر الثاني
ان اي دراسة وراثيه للكائنات الحيه تتطلب استخلاص (استخراج) جزيئة DNA نقية من العينة البيولوجية لغرض استخدامها في الدراسات الوراثية المختلفة لذلك فقد قام العلماء والباحثين بتطوير عدد من الطرق لاستخلاص الدنا تختلف في اسسها ومتطلباتها ولكل منها محاسن ومساوئ وهي كمايلي
1- طريقة المذيبات العضوية Organic solvent Method
2- طريقة التمليح الخارجي Salting out Method
3- طريقه مرشحات السيليكا Silica Membrane Method
4- طريقة المبادلات الايونية Chelix Method

مراحل عملية الاستخلاص: Basic Steps of DNA Extraction
بصوره عامه اي عملية استخلاص تمر بالمراحل التالية:
1- تهيئة الخلايا او العينة Sample or Cell preparation
ان اي عينه بيولوجية يراد استخلاص الدنا منها يجب ان يتم تحضيرها وتهيئتها لعملية الاستخلاص وكما يلي:

*عينة الدم : يتم من خلال سحب الدم في tube EDTA وليس heparin tube ؟
*عينة القشع: تعامل معامله خاصه بمادة تسمى ب liquefier ومثالها (NaOH-NALC) لتفكيك المواد المخاطية مما يسهل ازالتها والتخلص منها.
*عينة البكتريا: اذا كانت مستعمرات نامية على وسط صلب فيتم قشطها واعادة تعليقها بماده PBS ومن ثم تخلط. اذا كانت نامية في وسط لوريا Luria Broth فيتم عمل سنترفيوج لترسيب البكتريا واهمال الرائق واخذ راسب البكتريا المعلق بكمية من LB ومن ثم ينقل الى تيوب 1.5ml وعمل سنترفيوج واهمال الرائق.
(NaOH-NALC)= sodium hydroxide + N, acetyl L-cysteine
*عينة العظم: يستخدم التنظيف الميكانيكي بأداة حاده ومن ثم يستخدم هايبوكلورات الصوديوم لإزالة المواد العالقة بالعظم ومن ثم يقص جزي من العظم ويطحن ونهيئ العالق باستخدام PBS

2- غسل الخلايا Cells Wash
تغسل الخلايا باستخدام محلول PBS ؟ على الاقل ثلاث مرات ومن ثم نعمل سنترفيوج لإهمال الرائق واخذ الخلايا المترسبة. تمثل هذه الخطوة مع الخطوة السابقة عملية ال cell harvesting

3- تحليل الجدار او الغشاء الحيوي Cell wall and membrane lysis
تعتمد هذه الخطوة على نوع الخلية المراد استخلاص الدنا منها حيث تختلف الخلايا البكتيرية عن الحيوانية وكذلك عن النباتية وبالتالي فان المواد المستخدمة تختلف.
#للخلايا صعبة التحلل مثل خلايا الحشرات والنبات والفطريات يفضل استخدام ال cooling shock باستخدام ال liquid nitrogen .
نتيجة لهذه الخطوة سنحصل على حلالة الخلايا cell lysate الذي يحتوي على كل المكونات الخلوية بضمنها ال DNA .

4- مسخ البروتينات والانزيمات و ازاله الشوائب Protein precipitation
للتخلص من كل المكونات الخلوية عدا الدنا يتوجب علينا مسخ البروتينات والتخلص من الدهون وتمتاز هذه الخطوة بانها عامة حيث تستخدم مواد معينه لك انواع العينات المستخدمة. ان مسخ البروتينات والفوسفولبيد هو فقدان ذائبية هذه المواد وبالتالي يمكن ترسيبها وفصلها وبقاء الدنا ذائب في المحلول المائي وبالتالي تسحب الطبقة المائية الحاوية على الدنا للخطوات اللاحقة لترسيب الدنا.

5- ترسيب الـ DNA باستخدام الكحولات Dehydration
ويتم ذلك من خلال استخدام كحول الايثانول او الايزوبروبانول اوالكحول الايزواميلي والذي يعمل بدوره على عملية سحب الماء Dehydration وترسيب الدنا.

6- غسل جزيئات الحامض النووي Washing
ويتم ذلك من خلال استخدام كحول الايثانول او الايزوبروبانول اوالكحول الايزواميلي والذي يعمل بدوره على عملية سحب الماء Dehydration وبالتالي غسل الدنا.

7- اعاده جزيئات الحامض النووي الى حالتها الذائبة Rehydration
ويتم ذلك من خلال استخدام دارئ TE (pH 8.4) والذي بدوره يحافظ على الدنا بالهيئة الذائبة

فيما يلي سنذكر مميزات كل طريقه من الطرق الثلاث السابقة الذكر
اولا :طريقة المذيبات العضوية Organic Solvent Method
يستخدم خليط من المذيبات العضوية بعد عمليه تحطيم الخلايا لغرض التخلص من الاملاح والبروتينات التي تنفصل في طبقه المذيبات العضوية ويبقى الحامض النووي في الطبقة المائية , من المحاليل العضوية المستخدمة الفينول والكلوروفورم والكحول الايزواميلي
مساوئ هذه الطريقة :
*استعمال كميات كبيره من مواد سامه (الفينول والكلوروفورم) التي يجب التخلص منها بطرق بيولوجية صحيحه.
*ان الحامض النووي المستخلص بهذه الطريقة يكون قليل النقاوة.

محاسن هذه الطريقة :
*غير مكلفة اقتصاديا (رخيصة).
*ممكن الحصول على تراكيز عالية من الدنا.

المواد المستخدمة في هذه الطريقة:
1- دارئ TE :
يحضر بإذابة 10 ملي مولر من Tris-Hcl و 1 ملي مولر من EDTA في كمية من الماء المقطر وضبط الرقم الهيدروجيني الى 8 ثم اكمل الحجم الى لتر واحد بالماء المقطر وعقم بالمؤصدة. يستخدم لإذابة الدنا ويحافظ عليه وممكن ان يحفظ لفترات طويله تحت درجه حراره تراوح من 4 الى -20 مئوي.

2- محلول SDS بتركيز %25 :
حضر بإذابة 25 غم من مادة SDS في 100 مليلتر من محلول Saline-EDTA وضبط الاس الهيدروجيني إلى 8. يستخدم لمسخ البروتينات وتذويب الدهون Lipid Solublization وبالتالي تحطيم الاغشية الخلوية وخروج مكونات الخلية بضمنها الدنا.
3- محلول 5 مولار كلوريد الصوديوم
حضر هذا المحلول بإذابة 282.5 غم من كلوريد الصوديوم في لتر من الماء المقطر وعقم بالمؤصدة بدرجة 121?م وضغط 15 باوند/انج2 لمدة 15 دقيقة.
4- خليط المذيبات العضوية Organic Solvent Solution
تم تحضير هذا الخليط انياً بمزج الكلوروفورم والكحول الايزواميلي بنسبة (24 :1). يستخدم هذا الخليط لتكون طبقتين معزولتين تماما الطبقة المائية الحاوية على الدنا وطبقة المذيبات العضوية الحاوية على بقية المكونات.






طريقه العمل:
1) تلقيح 10 مل من الـ Lauria Bretani broth (LB) بمستعمرة مفردة نقيه وفتية من بكتريا الـ E. coli, وتحضن لمدة 18 ساعة بدرجة حرارة 37 م
2) يتم اجراء طرد مركزي للمزرعة البكتيرية بسرعة 6000 دورة / الدقيقة لمدة نصف ساعة ثم اهمل الراشح واخذ الراسب .
3) يغسل الراسب بـ 2 مل من دارئ TE ثم ينبذ بسرعة 6000 دورة / الدقيقة لمدة 15 دقيقة, تم تكرر عملية الغسل لمرتين او ثلاث مرات .
4) يضاف 600 مايكروليتر من محلول الـ SDS تركيزه 25% واختياريا 2 مايكروليتر من محلول الـ RNase ويوضع في حمام مائي بدرجة 55 م لمده ربع ساعه.
6) يضاف 2 ملليلتر من محلول كلوريد الصوديوم بتركيز 5مولاري ويتم تقليب الانبوبة مرتين او ثلاث مرات ثم تترك الانابيب بدرجة حرارة الغرفة .
7) يضاف (حجم/ حجم) من خليط الكلوروفورم – الكحول الايزواميلي (1:24 ) وتقلب الانابيب برفق لمدة نصف ساعة ,ثم تنبيذ الانابيب بالمنبذ المبرد بسرعة 6000 دورة/ الدقيقة لمدة نصف ساعة , تكرر هذه الخطوة 2- 3 مرات . كنتيجة لهذه الخطوة ستتكون طبقتين عليا مائية حاويه على الدنا وطبقة المذيبات الى الاسفل منها حاوية على بقية المكونات.
8) يتم سحب الطبقة المائية الحاوية على الدنا بهدوء وتنقل الى انابيب نظيفة ومعقمة ,ثم يضاف لها كحول ايزوبروبانول و تقلب الانابيب بهدوء الى ان تظهر شبكه مرئية بيضاء (DNA ).
9) ترفع شبكة الـ DNA المترسبة بواسطة ماصة باستور ذات نهاية معقوفة ومغلقة و تنقل الى انابيب ابندروف معقمة وتغسل بكحول الايثانول تركيزه 70% المبرد الى درجة 5 مئوي لمرتين الى 3 مرات ,ثم تترك الانابيب بدرجة حرارة الغرفة نصف ساعة لغرض تطاير الايثانول .
10) يذاب راسب الـDNA بأضافة 50 مايكروليتر من دارئ الـ TE ثم تحفظ بدرجة (- 20 م) لحين الاستعمال.
ملاحظه
- اذا كانت البكتريا موجبه لصبغه غرام يجب استخدام انزيم خاص (lysozyme ) لغرض خلخله جدار الخليه قبل اضافه محلول الـSDS وبالتالي سهوله تحطيمه
- يتم استخدام انابيب ابندروف او انابيب خاصه من البولي اثلين ولاتستخدم الانابيب الزجاجيه او انابيب البلاستيك الاعتياديه (لماذا)
- ان ماده الـ EDTA ماده مخلبيه chelating agent فادتها سحب الذرات الموجبه من جدار الخليه مما يسبب خلخلته وسهوله تحطمه
- ماده الـ SDS ماده منظفه detergent تستخدم لمسخ البروتينات
- يجب ان يكون الاس الهيدروجيني للمحاليل المستخدمه 8 ( لماذا)








5- دارئ التحميل (Loading buffer) :
حضر بإذابة 4 غم من مادة السكروز في 10 مل من الماء المقطر واضيفت اليه صبغة بروموفينول الازرق (Bromophenol blue) وحفظ بدرجة حرارة 4 م لحين الاستعمال.
6- دارئ TBE :
حضر بإذابة 0.089 مول من مادة Tris-base و 0.089 مول من حامض البوريك و0.002 مول من EDTA في كمية من الماء المقطر وعدل الرقم الهيدروجيني إلى 8 ثم أكمل الحجم إلى 1 لتر وعقم بالموصدة و فيما بعدحفظ بدرجة 4 م لحين الاستعمال
7- الايزوبروبانول يستخدم لترسيب الـ DNA
8- الايثانول يستخدم لغسل الـ DNA

طريقه التمليح الخارجي Salting-out methods
يستخدم في هذه الطريقه محاليل ملحيه عاليه التركيز مثل اسيتات البوتاسيوم واسيتات الامونيوم لغرض تحطيم الخلايا ومسخ البروتينات ,ثم تزال هذه الاملاح باجراء طرد مركزي ثم تضاف الكحولات لترسيب الـ DNA .هذه الطريقه غير كفوئه بسبب بقاء رواسب ملحيه من المحاليل المستخدمه مما يستدعي استخدام طرق تنقيه اخرى للتخلص من هذه الرواسب لذا تعتبر طريق مكلفه



طريقه الكت Promega DNA extraction kit
تكون هذه الطريقه اسرع كما ان نقاوه الحامض النووي المستخلص عاليه الا ان كميته قليله وتتم باستخدام محاليل جاهزه هي :-
1- Cell lysis solution & Nuclei lysis solution المحاليل المحطمه لجدار الخليه
2- Protein precipitation solution المحلول المرسب للبروتينات
3- DNA rehydration solution محلول منظم يستخدم لاذابه الـ DNA
(ما الغرض من حفظ الـ DNA بصورته الذائبه)
4- الايزوبروبانول يستخدم لترسيب الـ DNA
5- الايثانول يستخدم لغسل الـ DNA

طريقه العمل
1- بعد ان يتم الحصول على الراسب الحاوي على الخلايا يضاف 600µl من محلول Nuclei lysis solution , يخلط الراسب ثم تحضن الانابيب بدرجه 80?C لمده 5 دقائق ثم تبرد الى درجه حراره الغرفه
2- يضاف 200µl من محلول Protein precipitation solution ويخلط جيدا ثم يحفظ في الثلج لمده خمس دقائق بعدها تجرى عمليه طرد مركزي بسرعه 13000-16000دوره بالدقيقه لمده ثلاث دقائق
3- ينقل الراشح الى انبوبه ابندروف حاويه على 600µl ايزوبروبانول وبعد ترسب الـ DNA تجرى عمليه طرد مركزي بسرعه 13000-16000دوره بالدقيقه لمده ثلاث دقائق يهمل الراشح
4- يضاف 600µl من الايثانول الى الراسب يخلط جيدا لكن بهدوء (لماذا) ثم تجرى عمليه طرد مركزي بسرعه 13000-16000دوره بالدقيقه لمده ثلاث دقائق يهمل الراشح وتكرر هذه الخطوه 2-3 مره
5- يهمل الايثانول وتترك انابيب ابندروف الحاويه على الـ DNA المترسب مفتوحه في المختبر لضمان تطاير بقايا الايثانول
6- يضاف 100µl من محلول DNA rehydration solution تترك بدرجه حراره الغرفه لليله كامله لغرض السماح لجزيئات الحامض النووي بالذوبان بصوره كامله .



المادة المعروضة اعلاه هي مدخل الى المحاضرة المرفوعة بواسطة استاذ(ة) المادة . وقد تبدو لك غير متكاملة . حيث يضع استاذ المادة في بعض الاحيان فقط الجزء الاول من المحاضرة من اجل الاطلاع على ما ستقوم بتحميله لاحقا . في نظام التعليم الالكتروني نوفر هذه الخدمة لكي نبقيك على اطلاع حول محتوى الملف الذي ستقوم بتحميله .