انت هنا الان : شبكة جامعة بابل > موقع الكلية > نظام التعليم الالكتروني > مشاهدة المحاضرة

الاستخلاص بطريقه مرشحات السيليكا Silica Membrane Method (المختبر الثالث 2016)

Share |
الكلية كلية العلوم     القسم قسم علوم الحياة     المرحلة 4
أستاذ المادة حسين عليوي مطلب الدهموشي       18/01/2017 13:21:47
المختبر الثالث
الاستخلاص بطريقه مرشحات السيليكا Silica Membrane Method
تعد هذه الطريقة من افضل الطرق المستخدمة حاليا واكثرها شيوعا لكونها رخيصة نسبيا وكفؤة حيث يمكن الحصول على دنا نقي وبتراكيز جيده خلال ساعه واحده فقط. اساس عمل هذه الطريقة انها بعد طرح المكونات الخلوية بضمنها الدنا بعد تحلل الخلايا يرتبط الدنا بغشاء السيليكا (السيليكا موجبة الشحنة وبالتالي وضفت هذه الخاصية للارتباط بالدنا سالب الشحنة) الموجود في وسط عمود الفصل البلاستيكي ومن ثم تأتي خطوات غسل الدنا المتكرره للتخلص من بقايا البروتينات والمكونات الخلوية الاخرى ومن ثم نحصل على دنا نقي مرتبط بغشاء السيليكا بعد ذلك يتم فك هذا الارتباط باستخدام محلول TE buffer .



ويمكن تلخيص خطوات هذه الطريقة بمايلي:
Special Protocol: (For Bacteria)
Step 1-Sample Preparation
1- Transfer the appropriate number of bacterial cell (up to 1 x ) to a 1.5ml microcentrifuge tube (not provided) and centrifuge at full speed (14,000 rpm or 10,000 x g) for 1 minute. Then discard the supernatant.
2- Add 200 ?l of FATG Buffer and resuspend the pellet by vortex or pipetting. Incubate for 5 minutes at room temperature.
Step 2 –Cell Lysis
3- Add 200 ?l of FABG Buffer to the sample and vortex for 5 seconds.
4- Incubate for 10 minutes at 70?C or until the sample lysate is clear. During incubation, invert the tube every 3 minutes.
5- Preheat required Elution Buffer (for Step 5 DNA Elution) in a 70?C water bath.
6- (Optional Step): If RNA-free genomic DNA is required, add 5?l of 10 mg/ml RNase A to the sample and mix by vortex. Then incubate for 5 minutes at room temperature.
Step 3 – Binding
7- Add 200?l ethanol (96~100%) to the sample and vortex for 10 seconds. (Pipetting if there is any precipitate.)
8- Place a FABG Column to a 2ml collection tube. Transfer the sample mixture (including any precipitate) carefully to FABG Column. Centrifuge for 5 minute at full speed (14,000 rpm or 10,000 x g) and discard the 2ml collection tube. Place the FABG Column in a new 2ml Collection tube.
Step 4 – Washing
9- Wash FABG Column with 400?l W1 Buffer. Centrifuge for 30 seconds at full speed (14,000 rpm or 10,000 x g) and discard the flow-through.
10- Place the FABG Column back in the 2ml Collection tube. Wash FABG Column with 600?l Wash Buffer (ethanol added). Centrifuge for 30 seconds at full speed (14,000 rpm or 10,000 x g) and discard the flow-through.
11- Place the FABG Column back in the 2ml Collection tube. Centrifuge for an additional 3 min at full speed (14,000 rpm or 10,000 x g) to dry the column.
Step 5 – Elution
12- Place the dry FABG Column to a new 1.5ml microcentrifuge tube.
13- Add 100?l of Preheated Elution Buffer or TE to the membrane center of FABG Column. Stand FAGB Column for 3~5 min or until the buffer is absorbed by the membrane.
14- Centrifuge for 30 seconds at full speed (14,000 rpm or 10,000 x g) to elute the DNA .
Step Final - Pure DNA
15- Store the DNA fragment at 4?C or -20?C.

الاستخلاص بطريقه التمليح الخارجي Salting out Method
تمتاز هذه الطريقة بكونها رخيصة واكثر امانا من بقية الطرق . اساس عمل هذه الطريقة يعتمد على ترسيب الدنا بواسطة الاملاح (كلوريد الصوديوم) حيث يعمل ايون الصوديوم الموجب على الارتباط بمجموعة الفوسفات السالبة مسببا ترسيب الدنا. يتم التخلص من الاملاح فيما بعد باستخدام الايثانول 70%. من مساوئ هذه الطريقة الى انها تحتاج الى وقت طويل يصل الى 48 ساعه.




ويمكن تلخيص خطوات هذه الطريقة بمايلي:
Equipment and Materials

• Polypropylene tubes 15ml
• Lysis buffer (10mM Tris-HCL,400mM NaCl, 2mM Na2EDTA, pH 8.2)
• SDS 10%
• Proteinase K solution (1 mg proteinase K in 1% SDS and 2 mM Na2 EDTA).
• Centrifuge
• Absolute ethanol
• TE buffer (10mM Tris-HCL, 0.2mM Na2 EDTA, pH 7.5)
• Disposable gloves
• Gilson pipette


Procedure

1. Resuspend the buffy coats of nucleated cells obtained from blood with anticoagulents (ACD or EDTA) with 3ml of nuclear lysis buffer.
2. Digest the cell lysates, with 0.2 ml of 10% SDS and 0.5 ml of proteinase K solution, overnight at 37 °C.
3. Add 1ml of saturated NaCl (6M) to each tube and shake vigorously for 15 seconds.
4. Centrifuge for 15 minutes at 2500 rpm.
5. Transfer the supernatant containing the DNA to another 15ml polypropylene tube, the precipitated protein pellet is left behind at the bottom of the tube.
6. Add 2 volumes of absolute ethanol and invert the tubes several times until the DNA precipitates.
7. Remove the precipitated DNA with a plastic spatula or pipette and transfer to a 1.5ml microcentrifuge tube containing 100-200 microliter TE buffer
8. Dissolve the DNA for 2 hours at 37°C
9. Store the tube at +4 or –20°C.
10. Check quantity/quality of DNA (see QUALITY CONTROL OF DNA protocol)


Reference

Miller S.A, Dykes D.D, Polesky H.F : A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research 1988; V16 Number 3 : 1215

الاستخلاص بطريقه التمليح الخارجي Salting out Method
تمتاز هذه الطريقة بكونها رخيصة واكثر امانا من بقية الطرق . اساس عمل هذه الطريقة يعتمد على ترسيب الدنا بواسطة الاملاح (كلوريد الصوديوم) حيث يعمل ايون الصوديوم الموجب على الارتباط بمجموعة الفوسفات السالبة مسببا ترسيب الدنا. يتم التخلص من الاملاح فيما بعد باستخدام الايثانول 70%. من مساوئ هذه الطريقة الى انها تحتاج الى وقت طويل يصل الى 48 ساعه.




ويمكن تلخيص خطوات هذه الطريقة بمايلي:
Equipment and Materials

• Polypropylene tubes 15ml
• Lysis buffer (10mM Tris-HCL,400mM NaCl, 2mM Na2EDTA, pH 8.2)
• SDS 10%
• Proteinase K solution (1 mg proteinase K in 1% SDS and 2 mM Na2 EDTA).
• Centrifuge
• Absolute ethanol
• TE buffer (10mM Tris-HCL, 0.2mM Na2 EDTA, pH 7.5)
• Disposable gloves
• Gilson pipette


Procedure

1. Resuspend the buffy coats of nucleated cells obtained from blood with anticoagulents (ACD or EDTA) with 3ml of nuclear lysis buffer.
2. Digest the cell lysates, with 0.2 ml of 10% SDS and 0.5 ml of proteinase K solution, overnight at 37 °C.
3. Add 1ml of saturated NaCl (6M) to each tube and shake vigorously for 15 seconds.
4. Centrifuge for 15 minutes at 2500 rpm.
5. Transfer the supernatant containing the DNA to another 15ml polypropylene tube, the precipitated protein pellet is left behind at the bottom of the tube.
6. Add 2 volumes of absolute ethanol and invert the tubes several times until the DNA precipitates.
7. Remove the precipitated DNA with a plastic spatula or pipette and transfer to a 1.5ml microcentrifuge tube containing 100-200 microliter TE buffer
8. Dissolve the DNA for 2 hours at 37°C
9. Store the tube at +4 or –20°C.
10. Check quantity/quality of DNA (see QUALITY CONTROL OF DNA protocol)


Reference

Miller S.A, Dykes D.D, Polesky H.F : A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research 1988; V16 Number 3 : 1215


المادة المعروضة اعلاه هي مدخل الى المحاضرة المرفوعة بواسطة استاذ(ة) المادة . وقد تبدو لك غير متكاملة . حيث يضع استاذ المادة في بعض الاحيان فقط الجزء الاول من المحاضرة من اجل الاطلاع على ما ستقوم بتحميله لاحقا . في نظام التعليم الالكتروني نوفر هذه الخدمة لكي نبقيك على اطلاع حول محتوى الملف الذي ستقوم بتحميله .
الرجوع الىلوحة التحكم