انت هنا الان : شبكة جامعة بابل > موقع الكلية > نظام التعليم الالكتروني > مشاهدة المحاضرة

الاستخلاص بطريقه التمليح الخارجي Salting out Method (المختبر الرابع 2016)

Share |
الكلية كلية العلوم     القسم قسم علوم الحياة     المرحلة 4
أستاذ المادة حسين عليوي مطلب الدهموشي       18/01/2017 13:23:04
المختبر الرابع
الاستخلاص بطريقه التمليح الخارجي Salting out Method
تمتاز هذه الطريقة بكونها رخيصة واكثر امانا من بقية الطرق . اساس عمل هذه الطريقة يعتمد على ترسيب الدنا بواسطة الاملاح (كلوريد الصوديوم) حيث يعمل ايون الصوديوم الموجب على الارتباط بمجموعة الفوسفات السالبة مسببا ترسيب الدنا. يتم التخلص من الاملاح فيما بعد باستخدام الايثانول 70%. من مساوئ هذه الطريقة الى انها تحتاج الى وقت طويل يصل الى 48 ساعه.




ويمكن تلخيص خطوات هذه الطريقة بمايلي:
Equipment and Materials

• Polypropylene tubes 15ml
• Lysis buffer (10mM Tris-HCL,400mM NaCl, 2mM Na2EDTA, pH 8.2)
• SDS 10%
• Proteinase K solution (1 mg proteinase K in 1% SDS and 2 mM Na2 EDTA).
• Centrifuge
• Absolute ethanol
• TE buffer (10mM Tris-HCL, 0.2mM Na2 EDTA, pH 7.5)
• Disposable gloves
• Gilson pipette


Procedure

1. Resuspend the buffy coats of nucleated cells obtained from blood with anticoagulents (ACD or EDTA) with 3ml of nuclear lysis buffer.
2. Digest the cell lysates, with 0.2 ml of 10% SDS and 0.5 ml of proteinase K solution, overnight at 37 °C.
3. Add 1ml of saturated NaCl (6M) to each tube and shake vigorously for 15 seconds.
4. Centrifuge for 15 minutes at 2500 rpm.
5. Transfer the supernatant containing the DNA to another 15ml polypropylene tube, the precipitated protein pellet is left behind at the bottom of the tube.
6. Add 2 volumes of absolute ethanol and invert the tubes several times until the DNA precipitates.
7. Remove the precipitated DNA with a plastic spatula or pipette and transfer to a 1.5ml microcentrifuge tube containing 100-200 microliter TE buffer
8. Dissolve the DNA for 2 hours at 37°C
9. Store the tube at +4 or –20°C.
10. Check quantity/quality of DNA (see QUALITY CONTROL OF DNA protocol)


Reference

Miller S.A, Dykes D.D, Polesky H.F : A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research 1988; V16 Number 3 : 1215



المادة المعروضة اعلاه هي مدخل الى المحاضرة المرفوعة بواسطة استاذ(ة) المادة . وقد تبدو لك غير متكاملة . حيث يضع استاذ المادة في بعض الاحيان فقط الجزء الاول من المحاضرة من اجل الاطلاع على ما ستقوم بتحميله لاحقا . في نظام التعليم الالكتروني نوفر هذه الخدمة لكي نبقيك على اطلاع حول محتوى الملف الذي ستقوم بتحميله .
الرجوع الىلوحة التحكم