انت هنا الان: الرئيسية » القسم الاكاديمي
المقالات الاكاديمية والبحثية

براءة اختراع

    لتحميل الملف من هنا
Views  155
Rating  0
 ايمان محمد جار الله مسير 04/08/2018 16:35:09
تصفح هذه الورقة الالكترونية بتقنية Media To Flash Paper

1
تحذيذ تتابع الاحماض الامينية للببتيذات الفعالة المسخلصة من
لاكتىفىرين Lactophorin حليب الابل العراقية الطازج
Sequence of amino acids in effective lactophorin peptides extracted from Iraqi fresh camel milk
2
المىجس
تيدف الب ا رءة الحالية الى اثبات وجود الببتيدات المنخفضة الوزن الجزيئي ذات الفعالية الحيوية في
حميب الابل الخام وتقدير كميتيا وتحديد موقعيا وتتابع الاحماض الامينية باستخدام التقنيات الحديثة
وتحديد الظروف المثمى لفصل ىذه الببتيدات وتشخيصيا.حيث تم جمع عينات حميب الابل من وسط
وغرب الع ا رق وتم استخدام تقنية انابيب الترشيح الفائق ذات قدرة فصل ) 5kDa ( وتقنية كرموتوغ ا رفي
السائل عالي الاداء معكوس الطور Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography ( RP-HPLC ( واستخدام تقنية Nano- Electrospray Ionization- Quadrupoles- time-of-flight- Liquid chromatography- Mass spectrometry/Mass spectrometry ( Nano-ESI-Q-TOF-LC-MS/MS ( في فصل
وتنقية الببتيدات المنخفضة الوزن الجزيئي من حميب الابل الخام وتم تحديد ظروف الفصل
والتشخيص ،تم اكتشاف اربع ببيتدات منخفضة الوزن الجزيئي في حميب الابل الخام تمتمك فعالية
حيوية اطمق عمييا تسمية ناكة 1 ، 2 ، 3 ، 4 وتم تنقية وتشخيص وتحديد تتابع الاحماض الامينية في
ىذه الببتيدات الاربعة والتي تعود الى بروتين لاكتوفوريين Lactophorin مما يدلل عمى قدرة حميب
الابل الخام في قتل او تثبيط نمو انواع مختمفة من البكتريا المرضية وىذا بدوره يزيد من اىميتو الصحية
والعلاجية.
3
المفصل
1 المقذمة - Introduction
يعد حميب الأبل الغذاء الرئيس لأىل البادية وتعد الأبل بالنسبة لسكان البادية مصد ا ر ميماً لمغذاء
والرزق وتمتاز الأبل العربية بشكل خاص بأنيا تتكيف مع البيئة الحارة والصح ا رء وتستطيع الأبل ذات
السنام الواحد البقاء وتحمل مدة الجفاف في فصول السنة التي يقل فييا الغذاء والعمف ويعود ذلك
الى انيا قد طورت نظاماً خاصاً في داخميا يجعميا تتحمل العطش لمدة 20 يوماً وتتحمل درجات
ح ا ررة 42-34 °م عمى عكس الماشية الاخرى التي تنظم درجات ح ا ررة جسميا من خلال التعرق وفقدان
الماء (Schwartz & Dioli, 1992) فضلاً عن ذلك فإن الأبل تتبع نظاماً خاصاً جداً بنسبة الماء
في الحميب الذي تنتجة وذلك لمحفاظ عمى المولود الجديد من الجفاف (Yagil & Etzion, 1980) .
استخدم حميب الأبل الطازج والمتخمر في علاج الكثير من الام ا رض مثل مرض الاستسقاء
واليرقان والسل والربو والمشمانيا) El-Agamy et. al., 1992; Shalash, 1984
Abdelgadir et. al., 1998; Agrawal et. al., 2003 ; ( وتعود الاىمية الصحية لحميب الأبل
لوجود المركبات الحيوية Bioactive substances والتي يمكن ان تشتق من بروتينات الحميب
باستعمال انواع من بكتريا حامض اللاكتيك ) Elayan et. al., 2008 ; Quan et. al., 2008 .)
إن لحميب الأبل ومنتجاتو القدرة عمى خفض ضغط الدم وذلك لاحتوائو عل ببتيد
Angiotensin I-converting enzyme inhibitor (ACE-inhibitor ) إذ ان ىذا الببتيد
موجود في التركيب الاساسي لعدد من بروتينات الاغذية ومنيا بروتينات الحميب
( Jang & Lee, 2005; Minervini et. al .,2003 ; Alhaj et. al., 2012 ( كما احتوى
حميب الأبل عمى ببتيدات مشابو للانسولين ) Insulin/Insulin like substances ( وبت ا ركيز عالية
( Agrawal et. al .,2003 ( ولقد ثبت امتلاك حميب الأبل الفعل المثبط للاحياء المجيرية الموجبة
والسالبة لصبغة اك ا رم ومنيا بكتريا Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus , Salmonella typhimurium وىذه المواد المثبطة ىي اللايسو ا زيم و
بيركسيد الييدروجين واللاكتوفيرين واللاكتوربيركسيديز وبروتينات المناعة ) El-Agamy et. al .,1992 ( وقد يكون سبب الفعل التثبيطي ضد بكتريا ,Staphylococcus aureus ,Listeria
4
monocytogenes Escherichia coli, ىو اللاكتوبيروكسيديز وبيروكسيد الييدروجين والايسو ا زيم
( Benkerroum et. al .,2004 . )
2 تفاصيل الفكرة -
أدى التقدم العممي في الأجيزة اولتقنيات المستخدمة في فصل وتحميل المركبات المختمفة الى
تشخيص ما يعرف بالمكونات الفعالة حيوياً Bioactive component في الكثير من الأغذية
الحيوانية والنباتية والتي كان ليا الدور الحقيقي في علاج عدد من الأم ا رض ومن ىذه المكونات الفعالة
حيوياً ما يشتق من البروتينات او الدىون او السكريات ، ووجد أن ليذه المركبات عدة فوائد منيا خفض
ضغط الدم والتقميل من الكولسترول ومنع الأصابة بالسرطان اولفاي روسات وتثبيط البكتريا المرضية
والمسببة لتمف الأغذية ومن بين ىذه المركبات الفعالة حيوياً ىي الببتيدات المنخفضة الوزن الجزيئي
( Kris-Etherton et. al., 2002 ( وتيدف الب ا رءة الحالية الى:-
.1 استخدام التقنيات الحديثة في اثبات احتواء حميب الابل الع ا رقية الطازج عمى ببتيدات
منخفضة الوزن الجزيئي من خلال استخدام تقنية انابيب الطرد المركزي وبمرشحات
فائقة الدقة Amicon Ultra Centrifugal Filter Devices (Centericon) .
.2 تحديد الظروف الخاصة بفصل ىذه الببيتدات من حميب الابل الطازج.
.3 اثبات امتلاك ىذه الببتيدات فعالية في تثبيط نمو البكتريا المرضية .
.4 فصل الببتدات المنخفضة الوزن الجزيئي في حميب الابل الطازج والتي تمتمك فعالية
في تثبيط البكتريا المرضية باستخدام تقنية كرموتوغ ا رفي السائل عالي الاداء
معكوس الطور Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography ( RP-HPLC ( وتحديد ظروف الفصل المناسبة.
.5 تشخيص تتابعات الاحماض الامينية في الببتيدات المفصولو بالفق ا رت السابقة
باستخدام تقنية Nano- Electrospray Ionization- Quadrupoles- time-of-flight- Liquid chromatography- Mass spectrometry/Mass spectrometry ( Nano-ESI-Q-TOF-LC-
5
MS/MS ( وتثبيت الظروف المثمى بتحديد تتابعات الاحماض الامينية في الببتيدات
التي تمتمك فعالية حيوية .
.6 تحميل النتائج باستخدام برنامج PEAKS Studio 6.0 ومطابقة النتائج مع قاعدة
البيانات العالمية لحميب الابل باستخدام SwissProt.MAR.2013.fasta .
3 المواد وط ا رئق العمل -
عينات حليب الابل الطازج
تم جمع عينات حميب الابل من وسط وغرب الع ا رق ونقمت العينات بطريقة معقمة
ومبردة وتم فرز حميب الابل عمى 2500 xg لمدة 30 دقيقة بدرجة ح ا ررة الغرفة ( Moline et. al., 2000 .)
قياس الفعالية المضادة لمبكتريا
استخدمت الطريقة التي وصفيا Ghanbari واخرون ) 2012 ( في تقدير الفعالية المضادة
لمبكتريا باستخدام اطباق 96 wells micro-titter plates المجيزة من شركة
Orange Scientific وقد استخدمت فيو سلالات قياسية للانواع البكترية المرضية
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ، Streptococcus faecalis ATCC 13048 ، Shigella dysenteriae ATCC 11311 ،المجيزة من مختب ا رت كمية عموم وتكنموجيا
الاغذية في جامعة University Sains Islam Malaysia وسلالة Escherichia coli BL21(DE3) origami المجيزة من مختب ا رت كمية التقنات الاحيائية جامعة University Putra Malaysia وقد تمت تنمية السلالات المرضية في وسط مرق Tryptone Soya Broth المعقم في
انابيب اختبار في درجة ح ا ررة 37 °م لمدة 18 ساعة.
تقدير تركيز البروتين
استخدمت الطريقة التي وصوفيا Bradford و Heath ( 1976 ( في تقدير تركيز البروتين
وباستخدام المنحنى القياسي لالبومين المصل البقري ) BSA .)
6
تقدير تركيز الببتيدات
اتبعت طريقة ) OPA ) ?-Phthaldialdehyde في تقدير تركيز الببتيدات في حميب الابل
الطازج والمتخمر وتم تحضير المحاليل عمى وفق الطريقة التي وصفيا Church واخرون) 1983 )
وباعتماد المنحنى القياسي لمكموتاثيون ) Bordbar et. al ,. 2013 .)
الادعاءات
تحضير المستخلص المائي للحليب المتخمر ) WSE ) Water-Soluble Extracts :
تم تحضير المستخمص المائي Water soluble extract ( WSE ( لحميب الابل الفرز
الطازج حيث تم خفض الرقم الييدروجيني لمحميب الطازج الى pH=4.6 باستخدام حامض
الييدروكميك بتركيز 1عياري (N1 HCL) وتم تعريضو لمنبذ المركزي المبرد باستخدام 3000 X g
لمدة 30 دقيقة/ °4 م ومن ثم فصل ال ا رئق عن ال ا رسب.وتم ترشيح ال ا رئق باستخدام ورق ترشيح
(Whatman no. 2) وبعدىا تم تعريض ال ا رئق لمنبذ المركزي المبرد باستخدام 10 000 X g لمدة
30 دقيقة/ °4 م وبعدىا فصل ال ا رئق عن ال ا رسب وتم الحصول عمى المستخمص المائي لمحميب
WSE .ومن ثم تم تجفيده باستخدام جياز التجفيف بالتجميد Lyophilizer .
فصل الببتيدات بالطرد المركزي وبمرشحات فائقة الدقة
Amicon Ultra Centrifugal Filter Devices (Centericon) .
تم فصل الببتيدات الموجوده في المستخمص المائي WSE المجفد لحميب الابل الطازج بتقنية
الطرد المركزي والترشيح الفائق بانابيب اميكون إذ تم تحضير 10 % من المستخمص WSE وتعديل
الرقم الييدروجيني لممستخمص الى 6 باستخدام ) 5N NaOH ( وبواسطة انابيب اميكون 15 مل
ذات MMCO قدرة 10 كيمودالتن وعمى 5000Xg لمدة 20 دقيقة/ °4 م وحسب تعميمات الشركة
المجيزة . تم استبعاد ال ا رسب ) Retentate ( ونقل الجزء الناضح ) Permeate ( الى انابيب اميكون
ذات MMCO قدرة 5 كيمو دالتن وأج ا رء الترشيح الفائق بالنبذ المركزي المبرد 7500Xg لمدة 20
دقيقة/ °4 م وتم استبعاد ال ا رسب ) Retentate ( اولاحتفاظ بالجزء الناضح) Permeate ( الذي تم تقدير
7
الفعالية المضاده وتركيز الببتيدات والبروتينات في الجزء الناضح ومن ثم تجفيدة باستخدام
جياز Lyophilizer اولاحتفاظ بو تحت التجميد 85- °م لاج ا رء الاختبارت اللاحقة .
تنقية الببتيدات باستخدام كرموتوغ ا رفي السائل عالي الاداء ذو الطور المعكوس RP-HPLC :
اجبعث جقىية RP-HPLC في جىقية انببحيذات باسحخذاو وسب خهط مخحهفة مه انطىر انمححرك كما
) مىضح في انجذول ) 1
جدول ) 1 (الاسترداد بالخمط التدريجي لمطور المتحرك) B ، A )
situation a gradual mixing
Time (min)
100% Mobile phase A
0-10
Gradient elution
11-55
100% Mobile phase B
55-67.5
المىاد والمحاليل المستخذمة
تحضير الطور المتحرك لجهاز RP-HPLC -:
تم تحضير محاليل الطور المتحرك المؤلفة من الطور المتحرك A والذي يتكون من 0.1% من Trifluoroacetic acid HPLC grade ( TFA- HPLC grade ( في الماء الم ا زل منو
الايونات والطور المتحرك B يتكون من 0.1% من TFA في Acetonitrile HPLC grade (ACN- HPLC grade) وتم عممية ترشيح الطور المتحرك ) A ، B ( باستخدام ورق ترشيح 0.45?m (Millipore filter Co.) وا ا زلة الغاز Degassing باستخدام جياز ultrasonic المجيز من
شركة DELTA لمدة 15 دقيقة لضمان خم وه من الغا ا زت وحفظة في عبوات خاصة.
تحضير العينة لجهاز RP-HPLC -:
استخدم 150 ممغ ا رم من العينة المجفدة )الجزء الناضح من انابيب 5 kDa ( الم ا رد تحميميا
بجياز RP-HPLC إذ اذيبت في ميمميتر واحد من الطور المتحرك A ومن ثم ترشيحيا باستخدام ورق
ترشيح خاص 0.22 ?m (Millipore filter Co.) ووضعت العينة في عبوات محكمة الغمق
خاصة بجياز RP-HPLC .
8
طريقة تنقية الببتيدات بجهاز RP-HPLC -:
تم تحميل العينة المحضرة في الفقرة السابقة عمى جياز RP-HPLC المحتوي عمى عمود الفصل
a zorbax 300 SB-C18 column ( ?m 5 , 9.4 mm × 250 mm Agilent Technologies , USA ( وكان حجم النموذج المحقون داخل الجياز ىو 500 مايكورليتر ،
وبمعدل جريان 4 مل/دقيقة ، وجمعت الاج ا زء المفصولة بمعدل 6 مل لكل جزء وقيست الامتصاصية
عمى الطولين الموجيين 205 و 280 نانوميتر. وتم استرداد العينة باستخدام الخمط المتدرج
Gradient elution من نوعين من المذيبات كطور A و B في الأوقات والاضافات الموضحة
بالجدول) 1 ( .بعد جمع الاج ا زء المفصولة من جياز RP-HPLC تم تجفيدىا باستخدام جياز التجفيد
وحفظيا بالتجميد - °85 م ،ثم تمت اذابتيا بالماء الم ا زل منو الايونات المعقم وترشيحيا باستخدام ورق
ترشيح 0.22?m (Millipore filter Co.) لاستخداميا في تقدير تركيز الببتيدات وفقا لطريقة
OPA و جقذير جركيز انبروجيىات باسحخذاو طريقة بردفىرد و تم قياس الفعالية المضادة لمبكتريا عمى
وفق الطريقة التي وصفيا Ghanbari واخرون ) 2012 . )
تحديد تتابع الاحماض الامينية في الببتيدات الموجودة في الاج ا زء الفعالة حيويا باستخدام ) Nano-ESI-Q-TOF-LC-MS/MS ) Nano- Electrospray Ionization- Quadrupoles- time-of-flight- Liquid chromatography- Mass spectrometry/Mass spectrometry .
المواد والمحاليل المستخدمة
Pierce C18 Spin Columns -1
استخدمت الانابيب المجيزة من شركة ) Technologie Agilent ( الامريكية والمعباءة بمادة
C18 ذات الطور المعكوس بالنبذ المركزي 13.2x1000 لمد 15 دقيقة وتستخدم ىذه الانابيب
في تنظيف العينة والتخمص من باقيا الاملاح ولاغ ا رض اعداد العينات لتحميل LC-MS/MS .
2 مذيب - A مكون من 0.1 %من حامض الفورميك (Formic acid- HPLC grade) في الماء .
3 مذيب - B مكون من 90 % من نت ا رت الاسيتيل (ACN- HPLC grade) في الماء مع 0.1 %
من حاض الفورميك ) (Formic acid- HPLC grade .
9
تحضير العينة: تم أتباع طريقة تحضير العينة عمى وفق تعميمات الشركة المجيزة ) Agilent Technologies ( الامريكية وىي الخطوات الأتية:
- 1 اذيب 0.2 ممغ ا رم من العينة المجفدة )الاج ا زء المفصولة من RP-HPLC ( في 0.1 مل من
المذيب A
-2 سحب 30 مايكروليتر من العينة ) 2 mg/ml ( وتم تنظيفيا باستخدام انابيب Pierce C18 Spin Columns بالنبذ المركزي 13.2x1000 لمدة 15 دقيقة.
3 تم تنظيف العينة من الفقرة السابقة من الاملاح ثم تجفيفيا - speed evaporator ومن أ عادة
أذابتيا باستخدام 8 مايكرولتير من المذيب A عند أج ا رء الفحص.
طريقة وظروف العمل
استخدم نظام الدمج بين جياز HPLC(1200) مع جياز) 6520 ) LC MS/MS
( Agilent 1200 HPLC-Chip/MS Interface, coupled with Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS ) وبأستخدام رقائق مكونة من نوعين من اعمدة الفصل نوع
C18 ، الاول يقوم بتركيز عينة الفصل والثاني يعمل عمى تحميل العينة ) Large Capacity Chip, 300 ? , C18, 160nL enrichment column & 75umx150mm analytical column ( وبمعدل جريان 4 مايكروليتر /دقيقة باستخدام مضخة دفع Capillary pump في
جياز 1200 HPLC ومعدل جريان 0.3 مايكروليتر/دقيقة باستخدام مضخة نانوية Series Nano Pump ، وكان حجم أنموذج الحقن ىو 0.5 مايكروليتر، ونوع الايونات موجبة والفولتية
المستخدمة 175 فولت ودرجة ح ا ررة الغاز °325 م ومعدل مرور الغاز 5 لتر /دقيقة ومدى الكشف
في MS عن قيمة الكتمة الى الشحنة 110 - 3000 m/z اما في MS/MS فالمدى ىو 50 -
3000 m/z .
11
تحميل نتائج LC-MS/MS -:
تم تحميل النتائج ومعالجة البيانات باعتماد برنامج PEAKS Studio 6.0 اما مطابقة ىذه النتائج
مع البروتينات الموجودة في قاعدة البيانات العالمية فقد تم من خلال أستخدام برنامج
SwissProt.MAR.2013.fasta .
النتائج والمناقشة
وسائل اثبات الب ا رءة:-
1 فصل الببتيدات بالطرد المركزي وبمرشحات فائقة الدقة:- -
أحتوى الجزء الناضح Permeate لممستخمص المائي لحميب الابل الطازج عمى تركيز
81 مايكرغرام/مل من انببحيذات وكان جركيز انبروجيىات 8.4 مايكرغراو / مم بروجيه واظهر نسبة
تثبيط 22.4 % لبكتريا Staph. aureus ATCC 25923 ونسبة 27.0 % اتجاه St. faecalis ATCC 13048 وثبط بكتريا Shigella dysenteriae ATCC 11311 بنسبة 18 % وبكتريا
E.coli (DE3)origami بنسبة تثبيط 6.6 % وجاءت ىذه النتائج مقاربة لما وجده Salami
واخرون) 2010 ( بأن شرش حميب الابل يمتمك فعالية في تثبيط بكتريا E.coli إذ تصل نسبة التثبيط
الى 47 % بفعل التحمل الأنزيمي لشرش حميب الابل باستخدام أنزيم Proteinase K وتزداد نسبة
التثبيط الى 49 %في الجزء الناضح Permeate باستخدام أنابيب الترشيح الفائقة 3kDa مما يؤكد
أن الفعل التثبيطي يعود الى ببيتدات منخفضة الوزن الجزيئي تحتوي عمى احماض امينية بعدد 2 الى
20 حامضاً امينياً استطاعت النفاذ من ىذه الاغشية الدقيقة .
2 تنقية الببتيدات باستخدام كرموتوغ ا رفي السائل عالي الاداء ذو الطور المعكوس - RP-HPLC -:
تم تنقية الببتيدات الموجودة في الجزء الناضح Permeate من أنابيب 5kDa لممستخمص
المائي لحميب الابل الخام والمتخمر باستخدام كرموتوغ ا رفي بالسائل عالي الاداء معكوس الطور
RP-HPLC ، اذ يلاحظ من الشكل ) C 1 ( أن استخدام الخمط التدريجي في الطور المتحرك
11
لممذيب B ( 0.1% TFA/Acetonitrile ( مع المذيب A ( 0.1%TFA/water ( لضمان عممية تنقية
الببتيدات وفقا لصفةالكرىة لمماء Hydrophobicity ، وخلال الم ا رحل الاولى من التنقية قد تم
إستخدام الطور المتحرك المكون من المذيب A فقط ) 100 %( لضمان استرداد كل الببتيدات التي
تمتاز بالقطبية Polarity والمحبة لمماء Hydrophilic وبعد الزيادة التدريجية لممذيب B في الطور
المتحرك سوف تزداد درجة كره الماء وتقل القطبية حتى النياية)بعد وقت احتجاز 55 دقيقية ( إذ
يستخدم الطور المتحرك المكون من المذيب B فقط ) 100 %( )الشكل 1C ( وتم استرداد كل الببتيدات
التي امتازت بعدم قطبيتيا والكارىة لمماء وىذا ىو الاساس بعمل كرموتوغ ا رفي السائل عالي الاداء ذو
الطور المعكوس ) Mahoney &Hermodson ,1980 (. ومع قياس الامتصاصية عمى طول
موجي 205 نانوميتر الخاص بالببتيدات وقياس الامتصاصية عمى طول موجي 280 نانوميتر لتقدير
البرروتينات وتركيز الببتيدات بطريقة OPA وتركيز البروتينات بطريقة بردفورد وتقدير الفعالية
التثبيطية باستخدام تقنية اطباق 96 well لكل الاج ا زء المفصولة ، لوحظ من الشكل ) 1 A ( أن
بعض الببتيدات التي ظيرت خلال وقت الاحتجاز لل 10 دقائق الاولى من الاسترداد والتي تشير الى
أن ىذه الببتيدات امتازت بأن ليا قطبية عالية ومحبة لمماء أون الطور المتحرك مكون من المذيب
A) الماء مع TFA ( ولذلك تم استردادىا نتيجة عدم ارتباطيا بمادة عمود الفصل )الطور الثابت الكاره
لمماء ( فضلاً عن ذلك فقد ظي رت عدة بروتينات وبتركيز قميل جدا اذ وصل تركيز البروتينات في
الجزء الثالث F3 ( Fraction 3 ( اي بعد وقت احتجاز 4.5 دقائق الى 0.00045 ممغ ا رم /مل وفي
الجزء نفسو وصل تركيز الببتيديات الى 0.025 ممغ ا رم/مل)الشكل 2 ( وبعد وقت احتجاز 30 دقيقة
اي في الجزء العشرين F20 ازدادت نسبة المذيب B بنسبة اكبر عمى حساب نسبة المذيب A في
الطور المتحرك )الشكل 1C ( مما ادى الى زيادة اللاقطبية عمى حساب القطبية ومن ثم استرداد عدد
من الببتيدات المرتبطة بمادة عمود الفصل ومع استم ا رر خمط المذيبين A+B في الطور المتحرك
تظير عدد من الببتيدات وفقا لدرجة Hydrophobicity من خلال ق ا رءة الامتصاصية عمى 205
نانوميتر )الشكل 1A ( وكذلك تقديرىا بطريقة OPA إذ وصل تركيز الببتيدات في الجزء F20 ( Fraction 20 ( الى 0.012 ممغ ا رم/مل )الشكل 2( وظيور عدد من البروتينات من خلال ق ا رءة
الامتصاصية عمى 280 نانوميتر وبت ا ركيز قميمة جدا )الشكل 1B . )
إن جميع الاج ا زء المفصولة من الحميب الطازج بمغت 28 جزء وذلك لعدم ظيور اي
امتصاصية او اي تركيز بعد الجزء 28 ، ووجد أن ىذه الاج ا زء تمتمك فعالية تثبيط متفاوتو وبشكل
12
عام كانت منخفضة جدا اتجاه نمو البكتريا المرضية إذ لوحظ أن اعمى نسبة تثبيط تعود
الى الج زء F23 اذ اظير فعالية تثبيطية بنسبة 22.2 %ضد بكتريا St .faecalis 13048 ATCC
ونسبة تثبيط 23 % ضد بكتريا Staph. aureus ATCC 25923 )الشكل 4 ( ، مع ملاحظة أن
تركيز الببتيدات في ىذا الجزء وصل الى 0.013 ممغ ا رم/مل وأن تركيز البروتينات منخفض جدا إذ
وصل الى 0.0054 ممغ ا رم/مل )شكل 2 ( ، كما أظير الجزء F16 فعالية تثبيط منخفضة أتجاه بكتريا
Shigella dysenteriae ATCC 11311 إذ وصمت نسبة التثبيط الى 13 % اما فيما يخص
بكتريا E.coli (DE3) origami )الشكل 3 ( فمم تظير اي من الاج ا زء المفصولة من المستخمص
المائي لحميب الابل الطازج اي فعالية تثبيطية اتجاىيا.
13
الشكل) 1( فصل الببتيدات منخفضة الوزن الجزيئي بطريقة RP-HPLC من الجزء الناضح خلال
أنابيب 5 kDa لممستخمص المائي لحميب الابل الطازج ) (A عمى طول موجي 205 نانوميتر،
B ) (عمى طول موجي 280 نانوميتر ، C) (النسبة المئوية لخمط الطور المتحرك لممذيب B مع
المذيب A
14
شكل) 2 ( تركيز الببتيدات والبروتينات )ممغ ا رم/مل( في الاج ا زء المفصولة من الجزء الناضح خلال
أنابيب 5 kDa لممستخمص المائي لحميب الابل الطازج باستخدام RP-HPLC .
شكل) 3 (النسبة المئوية لمفعالية التثبيطية للاج ا زء المفصولة من الجزء الناضح خلال أنابيب 5 kDa
لممستخمص المائي لحميب الابل الطازج باستخدام RP-HPLC اتجاه بكتريا E.coli (DE3) origami وبكتريا Shigella dysenteriae ATCC 11311
15
شكل) 4 (النسبة المئوية لمفعالية التثبيطية للاج ا زء المفصولة من الجزء الناضح خلال أنابيب 5 kDa
لممستخمص المائي لحميب الابل الطازج باستخدام RP-HPLC اتجاه بكتريا St. faecalis ATCC 13048 وبكتريا Staph. aureus ATCC 25923 .
3 جوهر الب ا رءة تحديد تتابع الاحماض الامينية باستخدام - MS/MS في الببتيدات
المكونة للاج ا زء الفعالة والمفصولة باستخدام RP-HPLC لحميب الابل الخام.
في مقياس الطيف لمكتمة المتوالي MS/MS تمت تج زئة وتقطيع الببتيد الى ايونات متشضية والتي
يمكن التحسس بيا وقياس شدتيا intensity من خلال الكاشف في مقياس الطيف لمكتمة المتوالي
MS/MS .
تم اختيار عدد من الاج ا زء المفصولة باستخدام RP-HPLC والتي تمتمك فعالية عالية في التثبيط
من المستخمص المائي لمجزء الناضح باستخدام أنابيب الترشيح الفائق 5 كيمودالتن لمحميب الخام ، وقد
كان الجزء F23 من الحميب الخام ىو الاكثر فعالية لذلك تم اختياره لتحديد تتابع الاحماض الامينية
في الببتيدات باستخدام Nano-ESI-Q-TOF-LC-MS/MS ولزيادة نقاوة وتركيز ىذه الببتيدات
تم ام ا ررىا بجياز RP-HPLC المرتبط بشكل مباشر مع جياز LC-MS/MS وتم تحميل النتائج
باعتماد برنامج PEAKS Studio 6.0 وعمى وفق مطابقة ىذه الببتيدات لممعمومات الموجدوة في
قاعدة البيانات العالمية باستخدام SwissProt.MAR.2013.fasta الخاصة بحميب الابل. تم
تشخيص اربعة ببتيدات في الجزء الفعال وقد سميت )واكة 1 , 2 , 3 , 4 ( والتي تعود الى مواقع مختمفة
من جزئية ال lactophorin )الشكل 5 ( والذي يعد من بروتينات الشرش الرئيسة في حميب الابل
وتؤدي دو ًا ر ميمًا في الحماية ومنع الاصابة بالكثير من الام ا رض التي ممكن أن تصيب الحيونات
16
الرضيعة ولم تشر المصادر العممية الى عزل وتشخيص ببتيدات منخفضة الوزن الجزيئي وذات فعالية
حيوية في تثبيط البكتريا المرضية من Lactophorin حميب الابل في حين اشارت الكثير من
المصادر العممية الى ان الانزيمات الموجوده بشكل طبيعي في الحميب لو الدور الميم في تحمل
بروتينات الحميب فقد اشار O’Flaherty ( 1997 ( إلى امكانية عزل ببتيدات من حميب الابقار الطازج
تعود الى البيتا كازئين في مواقع مختمفة مثل f29-107 والموقع f29-97, f1-38 وذلك نتيجة
لفعل انزيمات تحمل البروتينات proteinases الموجودة بشكل طبيعي في الحميب، واكد Kelly
واخرون ) 2006 (عمى أن الحميب الطازج يحتوي عمى نظامين من انزيمات تحمل البروتين الاول : ىو
plasmin والثاني ىو lysosomal proteinases ضد الكائنات المجيرية وكلا النظامين يعملان
عمى تحميل بروتينات الحميب .
كما اكد Chove واخرون ) 2013 ( أن الانزيمات الموجود بشكل طبيعي وانزيمات البكتريا
المموثة لمحميب الطازج ليا الدور الرئيسي في زيادة التحمل البروتيني proteolysis ومياجمة بروتينات
الحميب اونتاج عدد من الببتيدات.
وقد اثبتت الد ا رسة الحالية ان ىذه الببتيدات والتي تم تشخيصيا تعود الى مواقع مختمفة من جزيئة
Lactophorin فقد كانت ثلاثة منيا من الموقع f 74-62 وواحد من الطرف الكاربوكسيمي f155-130 )جدول 3 الشكل 5 ( وتمتمك ىذه الببتيدات تتابعات وصفات مختمفة ، فقد وجد أن صافي الشحنة
الكيربائية لمببتيد )ناكة 1 ( يساوي - 1 عند الاس الييدرجيني 6 ولو وزن جزيئي 1229.6866 دالتن
تم تحديدىا باستخدام جياز MS/MS مقارنو بالوزن الجزيئي ) 1229.687 ( اولذي تم حسابة وفقا
لعدد الاحماض الامينية المكونو لو Asp-Leu-Val-Ser-Lys-Asp-Asp-Val-Val-Ile-Lys
ولو درجة كره لمماء 45 % وفقا لنسبة الاحماض الامينة الكاره لمماء وليذا الببتيد تركيب ثانوي مكون
من Extended strand= 27.27% ، 72.73% Random coil= وفقا لمطريقة Hierarchical Neural Network ( 1997 Guermeur, ( . اما ببتيد الثاني )ناكة 2 ( والذي يعود الى موقع 63 -
72 من جزيئة Lactophorin والذي لو صافي شحنة صفر ووزن جزيئي 1114.6598 دالتن ولو
درجة كرة لمماء 50 % وان 70 %منو يكون ذا تركيب ثانوي عشوائي اما الببتيد الثالث )ناكة 3 ( فان
61.53 %من تركيبة الثانوي يكون عمى شكل عشوائي ولو صافي شحنة - 1 اما ببتيد ال ا ربع
)ناكة 4 ( والذي يتكون من 26 حامض اميني وان وزنو الجزيئي الذي حدده MS/MS كان
3046.5256 دالتن وان 53 %من تركيبة الثانوي مكون من ? –helix .
17
ويلاحظ عدم احتواء ىذه الببتيدات عمى أواصر كبريتية لذلك تتخذ ىذه الببتيدات اشكال
عشوائية عند وجدوىا في المحاليل المائية ) Song et. al ,. 2012 ( وعند ارتباط ىذه الببتيدات
مع اي غشاء او بيئية كارىة لمماء فإنيا تأخذ ت ا ركيب ثانوية مختمفة secondary structure ( 2000 , Gennaro& Zanetti ( وأشارت الكثير من المصادر الى أن وجود التركيب الثانوي من
نوع ? - helix في الببتيدات يكون مقترناً مع فعالية عالية لمبيتدات تجاه البكتريا المرضية
( Park et. al ,.2000 ( كما ذكرت مصادر اخرى أن الببتيد المضاد من نوع indolicidin
والذي يفتقر الى التركيب الحموزني يكون ذا تركيب عشوائي فقط ويمتمك قدرة عمى اخت ا رق طبقة
الدىون المفسفرة في جدار الخمية ويؤدي الى احداث ثقب كبير ومن ثم موت الخمية البكتيرية
( Zhang et. al ,. 2001 ( .
وتستند الفعالية لكل الببتيدات المضاده للبكتريا على مبدأ انها محللة للجدار الخلوي لمببكتريا
membrane –lytic activity والتي تؤدي الى احداث قناة في الجدار الخموي لمبكتريا) Floris et. al,. 2003 ( ، وقد سجل وجود ببتيدات تحمل شحنة سالبة Anionic مضادة للاحياء المجيرية
وتتكون في الغالب من 5 - 70 حامضًا امينيًا والتي تكون غنية بالاحماض الامينية الكموتامك
والاسبارتك مع شحنة سالبة قد تصل الى - 7 ( Harris et. al,. 2009 ( ويمكن أن تشترك
الببتيدات الموجبة مع الببتيدات السالبو بشكل تازري synergistic في امتلاكيا فعالية مت ا زيدة ضد
البكتريا الموجبة والسالبة لصبغة ك ا رم إذ تساعد الببتيدات الموجبة عمى ارتباط الببتيدات السالبة بغشاء
الخمية ومن ثم تسبب اض ا رر تؤدي الى ىلاك الخمية فضلاً عن ذلك فإن اىداف الببتيدات السالبة ىي
الريبوسومات الموجودة في سايتوبلازم الخمية البكتيرية ) Grubor et. al,. 2006 . )
ولم تشير المصادر العممية الى تتابع الاحماض الامينية لببتيدات تمتمك فعالية مضادة في
حميب الابل الطازج وانما اكد El-Agamy واخرون) 1997 ( بأن حميب الابل يحتوي عمى ببتيدات
منخفضة الوزن الجزيئي تمتمك فعالية وظيفية.
الادعاءات
.1 طريقة تحضير المستخمص المائي water soluble extract(WSE) لحميب الابل الع ا رقية
الفرز الطازج.
.2 طريقة فصل الببتيدات من حميب الابل الع ا رقية الفرز الطازج باستخادم تقنية انابيب الترشيح
الفائق) 5 KD. Amicon .)
18
.3 استخدام تقنية RP-HPLC في فصل وتنقيية الببتيدات منخفضة الوزن الجزيئي من
المستخمص المائي لحميب الابل وباستخدام ظروف فصل خاصة.
.4 تحديد تتابعات الاحماض الامينية في الببتيدات المنخفضة الوزن الجزيئي والتي تمتمك فعالية
في تثبيط البكتريا المرضية وباستخدام تقنية متطورة وحديثة جدا.
.5 وجد ان حميب الابل الفرز الطازج يحتوي عمى ببتيدات منخفضة الوزن الجزيئي تمتمك فعالية
في تثبيط البكتريا المرضية وان ىذه الببتيدات تعود الى بروتين Lactophorin واطمق عمى
ىذه الببتيدات تسمية ناكة 1 و 2 و 3 و 4 وطمب حمايتيا من التضيع.
جدول ) 3 ( الببتيدات التي تعود الى lactophorin وتم الحصول عمييا من الجزء الفعال F23
المفصول باستخدام RP-HPLC لحميب الابل الطازج مع بعض صفاتيا
peptide name
Peptide sequence
Position Lactophorin
Observed mass(Da.)
Calculate mass(Da.) *%Hydrophobicity Charge under pH=6
**Secondary structure
ناكة 1
DLVSKDDVVIK
ccccccceeec
62 - 72 1229.6866
1229.687
45
-1
Extended strand 27.27%
Random coil 72.73%
ناكة 2
LVSKDDVVIK
cccccceeec
63 - 72 1114.6598
1114.660
50
0
Extended strand 30.00% Random coil 70.00%
ناكة 3
DLVSKDDVVIKSA
cccccceeeeecc
62 - 74 1387.7559
1387.756
46
-1)
Extended strand 38.46%
Random coil 61.53%
ناكة 4
LENTMRETMDFLKSLFPHASEVVKPQ
cchhhhhhhhhhhhhhcccccccccc
130 - 155 3046.5256
3046.526
38.46
0
Alpha helix 53.85%
Random coil 46.15%
*احتساب صفة الكره لمماء Hydrophobic وفقاً لنسبة الاحماض الامينية الكارىة لمماء الموجودة I, V, L, F, C, M, A, W) )
** الت ا ركيب الثانوية random coil =c e = extended strand h = ?- helix بالاعتماد عمى الموقع
Hierarchical Neural Network
19
شكل ) 5( موقع الببتيدات عمى جزيئية Lactophorin التي تم تشخيصيا في الجزء الفعال F23
لحميب الابل الطازج الصورة من شاشة برنامج PEAKS Studio 6.0
( http://bioinfor.com/peaksonline .)
انمصادر
? Abdelgadir, W. S.; Ahmed, T. K. & Dirar, H. A. (1998). The traditional fermented milk products of the Sudan. International Journal of Food Microbiology, 44: 1-13.
? Agrawal ,R.P.; Swami, S.C.; Beniwal, R.; Kochar, D.K.; Sahani ,M.S.; Tuteja, F.C.& Ghouri, S.K.( 2003). Effect of camel milk on glycemic control, risk factors and diabetes quality of life in type-1 diabetes: a randomised prospective controlled study. Journal Camel Practice Research, 10: 45–50.
? Alhaj,O. ; Bruckner,H.& Al-Khalifa.A.(2012). Identification of ACE-Iinhibitory precursor peptides from fermented camel milk (Camelus dromedarius) produced by Lactobacillus helveticus or Lactobacillus acidophilus using HPLC-MS.2nd Kiel Food 2nd Kiel Food Science Symposium. Kiel .Germany pp .33-34.
? Benkerroum, N.; Mekkaoui, M.; Bennani, N.; & Kamal, H. (2004). Antimicrobial activity of camel’s milk against pathogenic strains of Escherichia coli and Listeria monocytogenes. International Journal of Dairy Technology, 57:39-43.
? Bordbar ,S.; Ebrahimpour ,A. ; Abdul Hamid ,A. ; Abdul Manap, M. Y.; Anwar, F. and Saari1,N.(2013). The Improvement of The Endogenous Antioxidant Property of Stone Fish (Actinopyga lecanora)
21
Tissue Using Enzymatic Proteolysis. BioMed Research International, 2013:1-9.
? Bradford, j .A. and Heath, E. C. (1976) . A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein -dye binding. Analytical. Bioch. 72:248 -254.
? Chove, L. M.; Zacharia, A.; Grandison, A. S.& Lewis, M. J.(2013). Proteolysis of milk heated at high temperatures by native enzymes analysed by trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS) method. African Journal of Food Science, 7(8) : 232-237.
? Church, F. C.; Swaisgood, H. E.; Porter, D. H. & Catignani ,G. L. (1983). Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins. Journal Dairy Science, 66: 1219–1227.
? El-Agamy, E. I.; Ruppanner, R.; Ismail, A.; Champagne, C. P., & Assaf, R. (1992). Antibacterial and antiviral activity of camel milk protective proteins. Journal of Dairy Research, 59: 169-175.
? El-Agamy, E.I. ; Abou - Shloue , Z.I. & Abdel -Kader , Y.I. (1997) . A comparative study of milk proteins from different species II. Electrophoresis patterns, molecular characterization, amino acid
composition and immunological relationships. Proceedings 3rd Alexandria Conference of Food Science and Technology, Alexandria, Egypt, pp. 67 – 87.
? Elayan, A. A.; Sulieman, A. E. & Saleh, F. A. (2008). The hypocholesterolemic effect of Gariss and Gariss containing Bifidobacteria in rats fed on a cholesterol-enriched diet. Asian Journal of Biochemistry, 3:43-47.
? Floris, R.; Recio, I.; Berkhout, B.& Visser, S. (2003). Antibacterial and antiviral effects of milk proteins and derivatives thereof. Current Pharmaceutical Design ,9 ;1257–1275.
? Gennaro, R.& Zanetti, M. (2000).Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides. Biopolymers, 55: 31–49.
? Ghanbari, R.; Ebrahimpour, A.; Abdul-Hamid ,A.; Ismail ,A. & Saari,N. (2012). Actinopyga lecanora Hydrolysates as Natural Antibacterial Agents. International Journal of Molecular Sciences. 13, 16796-16811
? Grubor, B.; Meyerholz , D.K.& Ackermann, M.R.(2006). Collectins and cationic antimicrobial peptides of the respiratory epithelia. Veterinary Pathology,43, 595–612.
? Guermeur, Y. (1997). Combinaison de classifieurs statistiques, application à la prédiction de la structure secondaire des protéines. PhD thesis, Université Paris 6.
21
? Harris, F.; Dennison, S.R. & Phoenix, D.A. (2009).Anionic antimicrobial peptides from eukaryotic organisms. Current Protein and Peptide Science, 10:585–606.
? Jang, A.& Lee, M. (2005). Purification and Identification of Angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from beef hydrolysates. Meat Science, 69, 653-661.
? Kelly, A.L.; O’Flaherty, F.& Fox, P.F.(2006).Indigenous proteolytic enzymes in milk: A brief overview of the present state of knowledge. International Dairy Journal, 16(6): 499-716.
? Kris-Etherton, P.M.; Hecker, K.D.;, Bonanome, A.; Coval, S.M.; Binkoski, A.E.; Hilpert, K.F.; Griel, A.E.& Etherton, T.D.(2002).Bioactive compounds in foods: their role in the prevention of cardiovascular disease and cancer.AM.J.Med:113, Suppl 9B:71S-88S.
? Mahoney, W. C. & Hermodson, M. A. 0(1980). Separation of Large Denatured Peptides by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography. Journal of biological chemistry, 255(23): 11199-11203.
? Minervini, F.; Algaron, F.; Rizzello, C. G.; Fox, P. F.; Monnet, V. & Gobbetti, M. (2003).Angiotensin I-converting-enzyme inhibitory and antibacterial peptides from Lactobacillus helveticus PR4 proteinase hydrolyzed caseins of milk from six species. Applied and Environmental Microbiology, 69: 5297-5305.
? Moline, E. ; DE Frutos , M.& Ramos, M.(2000). Capillary electrophoresis characterization of the casein fraction of cheeses made from cows, ewes and goats milks. Journal of Dairy Research,67:209-216.
? O’Flaherty, F. (1997). Characterization of some minor caseins and proteose peptones of bovine milk. M.Sc thesis, Cork, Ireland: National University of Ireland.
? Park, C.B.; Yi, K.S.; Matsuzaki , K.; Kim, M.S.& Kim, S.C.( 2000).Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A derived antimicrobial peptide: the Proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proc. Natl. Academic Science USA, 97: 8245–8250.
? Quan, S.; Tsuda, H. & Miyamoto, T. (2008). Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides in skim milk fermented with Lactobacillus helveticus 130B4 from camel milk in Inner Mongolia, China. Journal of the Science of Food and Agriculture, 88: 2688-2692.
? Quiros, A.; Herna´ndez-Ledesma, B.; Ramos, M.; Amigo, L. & Recio, I. (2005). Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of peptides derived from caprine Kefir. Journal of Dairy Science, 88, 3480–3487.
22
? Salami, M. Moosavi-Movahedi, A.A. ; Ehsani ,M.Z. ;Yousefi, R.; Haertlé, T.; Chobert, J-M. ; Razavi ,S.H.; Henrich, R. ;Balalaie, S.; Ebad, S .A.; Pourtakdoost, I. & Niasari-Naslaji A.(2010). Improvement of the Antimicrobial and Antioxidant Activities of Camel and Bovine Whey Proteins by Limited Proteolysis. Journal Agriculture Food Chemistry, 58: 3297–3302.
? Schwartz, H. J. & Dioli, M. (1992).The one-humped camel (Camelus dromedarius) in eastern Africa: a pictorial guide to diseases, health care and management. Verlag Josef Markgraf, Weikersheim, Germany.
? Shalash, M. R. (1984). The production and utilization of camel milk. In W. R. Cockrill (Ed.), The Camelid: An all-purpose animal (pp. 196-208). Uppsala, Sweden: Scandinavian Institute of African Studies.
? Song, R.; Wei, R.;, Yu Luo, H.& Wang, D.(2012). Isolation and Characterization of an Antibacterial Peptide Fraction from the Pepsin Hydrolysates of Half-Fin Anchovy (Setipinna taty). Molecules , 17: 2980-2991
? Zhang, L.; Rozek, A. & Hancock, R.E.W. (2001).Interaction of cationic antimicrobial peptides with model membranes. Journal Biology Chemistry, 276: 35714–35722.

  • وصف الــ Tags لهذا الموضوع
  • حليب الابل العراقية الطازج ,لاكتىفىرين,تتابع الاحماض الامينية

هذه الفقرة تنقلك الى صفحات ذات علاقة بالمقالات الاكاديمية ومنها الاوراق البحثية المقدمة من قبل اساتذة جامعة بابل وكذلك مجموعة المجلات العلمية والانسانية في الجامعة وعدد من المدنات المرفوعة من قبل مشرف موقع الكلية وهي كالاتي:

قسم المعلومات

يمكنكم التواصل مع قسم معلومات الكلية في حالة تقديم اي شكاوى من خلال الكتابة الينا,يتوجب عليك اختيار نوع الرسالة التي تود ان ترسلها لادارة الموقع :