ناقش قسم علوم الحياة اطروحة الدكتوراه للطالبة ( طيف حسين أمين).الموسومة (تنقية وتوصيف الارجنين ديأمينيز المنتج من العزلات السريرية لبكتيريا الكلبسيلا الرئوية) بأشراف الدكتور محمد عبد الله جبر .. تضمن البحث استخلاص وتنقية إنزيم الأرجينين ديأمينيز من الكليبسيلا الرئوية .
تمكنت الباحثة من الحصول على 150 عينة سريرية من حروق وجروح وعدوى المسالك البولية من مستشفى الحلة التعليمي في بابل ومستشفى مرجان خلال الفترة من 1/2/2022 إلى 1/8/2022. باستخدام المعايير المورفولوجية والزرعية، كشفت النتائج التشخيصية الأولية والثانوية أن 100 من هذه العزلات تنتمي إلى جنس الكليبسيلا الرئوية.
استطاعت الباحثة من التحقق أيضًا من تشخيص العزلات بواسطة الطريقة الجزيئية باستخدام تقنية PCR و16s RNA. تم اختبار هذه العزلات الـ 100 لقدرتها على إنتاج إنزيم الأرجينين ديامينيز، وأظهرت النتائج أنها تقوم بذلك بدرجات متفاوتة. تم تحديد أن الكليبسيلا الرئوية N1 تحتوي على أعلى نشاط للانزيم (12 وحدة/ملغ بروتين). تم اختيار هذه العينة للبحث باضافة 0.5? من اللاكتوز و0.5? من مستخلص الخميرة إلى وسط الإنتاج، جنبًا إلى جنب مع 50 ملمولار من الأرجينين، وحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، والحفاظ على pH 7.5 أدى إلى أعلى إنتاج لإنزيم الأرجينين ديامينيز. تم تحديد كيفية تأثير عناصر مختلفة في وسط الزرع على إنتاج إنزيم الأرجينين ديامينيز. وقد خضع إنزيم الأرجينين ديامينيز لعملية تنقية ثلاثية المراحل: أولاً، تم ترسيبه بواسطة كبريتات الأمونيوم المشبعة بنسبة 70?، ثم تم تعريضه لكروماتوغرافيا تبادل الأيونات على عمود سليلوز DEAE، وأخيرًا تم تعريضه لكروماتوغرافيا ترشيح الجل على عمود سيفادكس G-100. بعد تنقية 5.9 مرات واسترداد الإنزيم بنسبة 38?، كان للإنزيم المعزول نشاط محدد قدره 164.2 وحدة/ملغ. ذروة نشاطه كانت عند pH=6، وهو أكثر استقرارًا في نطاق( pH (6-7. لوحظ أن أعلى درجة حرارة لنشاط الإنزيم كانت عند 37 درجة مئوية، وتبين أنه أكثر استقرارًا في درجات الحرارة بين 37 و 50 درجة مئوية.
كما تمكنت الباحثة من تقليل نشاط إنزيم الأرجينين ديامينيز قليلًا بواسطة EDTA وZnSo4 وNANO3، وتم رفع نشاط الإنزيم المتبقي إلى 110? و 125? على التوالي باستخدام FeCl3 وMnCl2. استخدام إنزيم الأرجينين ديامينيز المنقى لاكتشاف النشاط السمي له ضد خطوط خلايا السرطان المختلفة مثل A172 وMG63 وPC3 وMCF-7. كانت قيمة IC50 لخط الخلايا السرطانية في الدماغ (A172) وخط الخلايا السرطانية في البروستاتا (PC3) وخط الخلايا السرطانية في الكبد (MG63) وخط الخلايا السرطانية في الثدي (MCF7) على التوالي (94.98، 112.9، 92.74، و 71.04 ميكروغرام/مل). ووفقًا لهذه النتائج، تم اختيار خط الخلايا السرطانية في الثدي (MCF7) لمزيد من المعايير البيولوجية.
تم اختبار خمسة معايير خلوية (عدد الخلايا الحية VCC، شدة النواة NI، نفاذية غشاء الخلية CMP، الجهد الكهربائي للغشاء الميتوكوندري MMP، والسيتوكروم C) على خط الخلايا MCF7 بعد تعرضه لـ HCS لمدة 24 ساعة بأربع تراكيز مختلفة (200، 100، 50، و 25 ميكروغرام/مل) من إنزيم الأرجينين ديامينيز المنقى. أظهرت النتائج أن 200 و 100 ميكروغرام/مل لديهما التأثير الأعلى والملحوظ على جميع المعايير مقارنة بالسيطرة (الخلية غير المعاملة). أما 50 و 25 ميكروغرام/مل فقد أظهرت نتائج تشابهت بشكل كبير مع تلك للخلايا غير المعاملة التي تعمل كسيطرة سلبية (-ve). زاد إنزيم الأرجينين ديامينيز من إنتاج ROS في خط الخلايا MCF7. تم اكتشاف زيادة معتمدة على الجرعة في نشاط الكاسبيز 8 و 9 في خط الخلايا MCF7 المعالج بإنزيم الأرجينين ديامينيز.
استنتجت الدراسة ان تضخيم جين الرنا الريباسي 16s لـ K. الرئوية، مما يثبت هويته. ويمكن استخدام العزلة المحلية لـ K. pneumoniae N1 كمصدر فعال لإنتاج إنزيم ديميناز الأرجينين. وتحسين الظروف الغذائية والبيئية لـ ADI التي تنتجها عزلة K. pneumoniae N1 عندما يتم إضافة 0.5% من اللاكتوز كمصدر للكربون في الحد الأدنى من وسط الملح، و0.5% مع مستخلص الخميرة كمصدر للنيتروجين، وتركيز أرجينين 50 ملم، ثم تم تعديلها عند الرقم الهيدروجيني 7.5، وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 .
اوصت الباحثة على اهمية دراسة الهندسة الوراثية للإنزيم في محاولة لتحسين إنتاجيته وثباته.وعمل دراسات إضافية على تثبيط إنزيم ديميناز الأرجينين باستخدام طرق مختلفة للأغراض التطبيقية. ودراسة النشاط المضاد للأورام للإنزيم في الجسم الحي. فضلا عن عمل دراسات إضافية في تثبيت إنزيم ديميناز الأرجينين باستخدام طرق مختلفة للأغراض التطبيقية و مضادات البكتيريا والالتهابات للأرجينين ديميناز المنقى.